小鼠密质骨间充质干细胞的分离、培养及鉴定

目的：建立一种易操作的、高效的小鼠间充质干细胞（mMSC）的分离培养方法，并对其表面标志和多向分化潜能进行鉴定，为mMSC的获取提供了新的实验依据。方法：选取2～3周龄C57BL／6小鼠，取出双侧股骨、胫骨，冲出其内骨髓细胞并弃掉，将骨段剪成小块，胶原酶消化后用组织块培养法培养出MSC。倒置显微镜观察其生长过程，流式细胞术检测其表面标志，并对其进行成脂及成骨鉴定。结果：使用该方法分离培养的mMSC形态均一、生长良好，细胞形态呈成纤维细胞样，表达CD29和Scal-1，不表达CD34、CD45和CDllb，并具有成骨成脂潜能。结论：利用本操作方法，可以从小鼠密质骨中成功分离培养得到MSC，且高效易行。

小鼠胰岛的分离和移植

目的改进小鼠胰岛分离和移植方法。方法利用胆总管穿刺方法灌注胰腺,滤网过滤后人工挑取方法纯化胰岛;采用肾被膜下胰岛移植方法进行移植;用双硫棕(DTZ)染色方法鉴定分离纯化后的胰岛并计数;血糖仪动态检测胰岛移植后糖尿病小鼠血糖值;免疫组织化学染色观察肾脏被膜下胰岛存活情况。结果分离纯化后获得高纯度胰岛,可被DTZ染成猩红色,呈圆形或椭圆形;经计数每只小鼠可获胰岛(134±12)个;肾脏被膜下胰岛移植后血糖检测显示,移植胰岛后糖尿病小鼠可长期维持正常血糖值,移植胰岛在小鼠体内发挥了正常功能;免疫组织化学染色显示移植入的胰岛生存状态良好。结论依改进后的技术方法进行胰岛分离和移植,分离获得的胰岛纯度高、活力强,移植物功能正常、存活时间长,是一种简捷稳定的技术方法。

上调细胞周期相关蛋白-1的表达对脑胶质瘤U251细胞的增殖和迁移能力的影响

目的细胞周期相关蛋白-1(Caprin-1)与肿瘤的发展进程及药物耐受密切相关。文中旨在探讨Caprin-1在脑胶质瘤临床标本中的表达情况及其对脑胶质瘤细胞系生物学特性的影响。方法选取湖北医药学院附属十堰市太和医院神经外科2015年12月至2017年4月手术切除的29份脑胶质瘤肿瘤组织和2份因外伤死亡尸检的正常脑组织标本。以U251细胞作为实验对象,构建Caprin-1高表达的U251细胞稳转株。实验分为3组:空白对照组(无转染的野生型U251细胞)、阴性对照组(转染p EGFP-C1质粒的U251细胞)、实验组(转染p EGFP-C1-Caprin-1质粒的U251细胞)。RT-PCR和Western blot分别检测3组细胞Caprin-1 mRNA和蛋白的表达水平,检测其增殖能力变化及划痕实验和Transwell小室迁移实验检测其迁移能力的变化。结果正常脑组织Caprin-1表达量(65.04±1.07)低于WHOⅡ、WHOⅢ、WHOⅣ胶质瘤的表达量(145.9±22.0、444.4±110.0、1661.0±54.5),WHOⅡ、WHOⅢ、WHOⅣCaprin-1表达量依次升高,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组Caprin-1 mRNA、Caprin-1蛋白表达[(1.70±0.19)、(1.07±0.09)]明显高于空白对照组[(0.89±0.10)、(0.52±0.04)]、阴性对照组[(0.98±0.08)、(0.58±0.03)],差异有统计学意义(P<0.05)。实验组A值(2.55±0.14)明显高于空白对照组(1.40±0.06)和阴性对照组(1.35±0.04),差异有统计学意义(P<0.001)。实验组在每个视野下迁移的细胞数[(526.00±42.19)个]明显多于空白对照组和阴性对照组[(289.00±29.24)、(279.00±32.48)个],差异有统计学意义(P<0.001)。实验组中Cyclin D1和AKT磷酸化水平表达量明显高于空白对照组和阴性对照组(P<0.000)。结论 Caprin-1在胶质瘤标本中的表达量随肿瘤组织的恶性程度增加而增高,且上调U251细胞Caprin-1的表达则其增殖和迁移能力提高,为胶质瘤的基因靶向治疗及评估胶质瘤的预后提供理论依据。

利用Red/ET同源重组构建新型CCR5Δ32打靶载体

目的:目前应用TALENs或CRISPR-Cas基因编辑技术修饰CCR5基因以获得抗HIV功能的研究策略基本是破坏CCR5基因而不是制造CCR5Δ32这样天然存在的抗HIV基因型。为此,我们尝试通过细菌内同源重组技术构建一个新颖的CCR5Δ32的打靶载体,以便能够用于制备CCR5Δ32基因突变细胞系。方法:首先利用Red/ET同源重组系统将rpsl-neo片段插入细菌人工染色体(BAC)的CCR5基因中,随后再次利用同源重组将一个不含32 bp区域的非选择性52 bp片段替换该rpsl-neo片段,从而将BAC中的CCR5基因改造成CCR5Δ32基因型,最后将loxp-neo-loxp抗性基因插入CCR5基因的第2内含子区域,制备出含有抗性基因的CCR5Δ32打靶载体,该载体可在Cre酶作用下删除neo基因但只留下一个loxp在基因的内含子区。结果:rpsl-neo片段成功插入CCR5之Δ32区并为非选择性52 bp片段替换,loxp-neo-loxp成功插入内含子区。结论:通过Red/ET同源重组技术获得CCR5Δ32-loxp-neo-loxp打靶载体。

MSC介导的尸删基因体外作用于人DBTRG胶质瘤细胞的实验研究

目的将人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因（PTEN）转染间充质干细胞（MSC），检测MSCPIEN细胞基因产物的表达及其培养上清对人DBTRG胶质瘤细胞的作用。方法原代培养人脐带MSC，将PTEN基因表达质粒pDsRed-PTEN转染MSC,培养48h后荧光显微镜观察转染效果。将转染后MSCPTEN作为实验组，单纯MSC作为对照组。RT-PCR、Westem blotting、ELISA分别检测2组细胞删基因、蛋白及上清液中分泌性PTEN蛋白的表达：将体外培养的DBTRG细胞分为4组，分别加入MSC上清液和比例为25％、50％、100％的MSCPTEN上清液，继续培养24h，细胞活性／细胞毒性试剂盒（CalceinAM／EthD-1染色）观察4组细胞的活性；将体外培养的DBTRG细胞分为3组，分别加入MSC上清液和比例为25％、100％的MSCPTEN上清液．实时细胞记录仪（RTCA）检测DBTRG细胞的生长曲线。结果荧光显微镜下显示大量红色荧光位于MSCPTEN细胞胞内；RT-PCR、Westem blotting检测发现，实验组细胞PTEN基因、蛋白的表达高于对照组。ELISA检测显示实验组细胞上清液中PTEN含量[（1．514±0．389）ng／mL]高于对照组[（0．508±0．197）ng／mL]，差异有统计学意义（P〈0．05）；CalceinAM／EthD-1染色显示，25％、50％、100％MSCPTEN上清液组DBTRG细胞死亡数量较MSC上清液组明显增多．且随着MSCPTEN上清液比例的增加．死亡细胞的数量增多，差异均有统计学意义（P＜0．05）；RTCA检测显示，在加入不同上清液20h左右，与MSC上清液组比较，25％MSCPIEN上清液组DBTRG细胞指数明显下降，100％MSCPTEN上清液组DBTRG细胞指数显著下降。结论PTEN质粒转染MSC后MSCPTEN细胞能够稳定表达目的基因，其培养上清液明显促进人DBTRG胶质瘤细胞死亡、抑制肿瘤细胞生长，MSC介导的PTEN基因可能成为胶质瘤基因治疗的一种有效方法。