pCMV-Myc-PIASxβ重组质粒的构建与蛋白表达

目的:通过基因重组方法构建pCMV-Myc-PIASxβ质粒,在真核细胞中高效表达重组蛋白并进行检测。方法:用SalⅠ和NotⅠ将PIASxβ片段从pGADT7载体中酶切后,利用DNA重组技术将其定向插入pCMV-Myc载体中。获得正确重组质粒后,瞬转CHO细胞系,用Western blotting检测Myc-PIASxβ重组融合蛋白表达。结果:经过酶切,片段回收,连接转化,获得重组质粒。重组pCMV-Myc-PIASxβ克隆通过酶切和测序鉴定其正确性。EcoRⅠ酶切鉴定,pCMV-Myc-PIASxβ为一条大小5 641 bp的条带;XbaⅠ酶切鉴定,pCMV-Myc-PIASXβ为2条大小分别为3 291和2 349 bp的条带,符合预计大小。Western blotting检测证实,在相对分子质量68 000处(PIASxβ融合蛋白)有特异的蛋白表达条带,与重组质粒相符。结论:成功构建了pCMV-Myc-PIASxβ重组质粒,为深入研究PIAS家族的功能奠定良好的基础。

水通道蛋白1-C末端肽段/GST融合蛋白的原核表达(简报)

水通道蛋白（Aquaporin，AQP）是一类选择性高效转运水分子的细胞膜通道蛋白，广泛存在于原核和真核生物细胞的细胞膜上．主要介导自由水分子的被动跨膜转运．对保持细胞内外液环境的稳态平衡起着重要的作用。AQP1是第一个被发现鉴定的水通道蛋白．它是1988年Agre等从红细胞膜分离纯化Rh血型多肽时偶然发现的一个分子量为28KD的疏水性跨膜蛋白．称为形成通道整合膜蛋白28（CHIP28）。Agre因此获得了2003年的诺贝尔奖。水通道蛋白AQP1广泛地表达于红细胞、肾、眼、肺，脉络丛和血管内皮，在体液转运中发挥作用。

PIAS3的Myc融合蛋白真核表达重组质粒的构建

目的:构建PIAS3(活化型STAT3抑制蛋白)的Myc融合蛋白真核表达重组质粒,并表达融合蛋白Myc-PIAS3。方法:采用PCR方法,扩增鼠PIAS3基因全长cDNA编码区序列。将该1851bp的特异性片段连接到T载体上,将其亚克隆至pCMV-Myc真核表达载体的SalⅠ和NotⅠ位点之间。将pCMV-Myc-PIAS3重组质粒转染前列腺癌PC3细胞,利用Myc抗体通过Western blotting法检测融合蛋白Myc-PIAS3的表达。结果:重组pCMV-Myc-PIAS3质粒通过酶切和测序鉴定了其正确性。EcoRⅠ酶切鉴定时有4357和1318bp2条带,XbaⅠ酶切鉴定时有3291bp和2384bp2条带,与预期结果一致。测序结果显示,13个氨基酸Myc在N端,然后是阅读框架正确的PIAS3的基因序列。pCMV-Myc-PIAS3重组质粒转染PC3细胞,利用Myc抗体通过Western blotting法检测融合蛋白Myc-PIAS3的表达,在相对分子质量68000处检测到特异的蛋白表达条带。结论:成功构建pCMV-Myc-PIAS3重组质粒,并表达融合蛋白Myc-PIAS3。

基于生物信息学分析ZNF217在低级别胶质瘤中表达的临床意义

目的利用生物信息学分析ZNF217在低级别胶质瘤(LGG)中表达的临床意义。方法通过GEPIA、HPA、UALCAN、CGGA、TIMER2.0、cBioPortal和LinkedOmics等数据库对低级别胶质瘤患者ZNF217的差异表达、临床病理特征、预后价值、免疫细胞浸润、基因突变和启动子甲基化水平进行分析。结果LGG组织中ZNF217 mRNA和蛋白表达水平较正常组织上调(P<0.05),ZNF217 mRNA表达水平与患者的肿瘤分级、免疫细胞浸润及相关标志物呈正相关(P<0.05),与患者总生存期和无病生存期呈负相关(P<0.05)。ZNF217发生基因突变和启动子低甲基化(P<0.05),进而导致LGG患者预后不良(P<0.05)。结论ZNF217在LGG中表达上调,其高表达与LGG患者预后不良有关,ZNF217可能成为LGG预后生物标志物和潜在的治疗靶点。

类泛素化修饰蛋白SUMO3/GST融合蛋白表达载体的构建及表达

目的:构建pGEX-4T-1/SUMO3重组表达质粒,并在大肠杆菌中表达和纯化出类泛素化修饰蛋白SUMO3/GST融合蛋白。方法:采用PCR技术利用pcDNA3.1-SUMO3质粒为模板,扩增出SUMO3全长编码序列(312bp),并将其重组于谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达质粒pGEX-4T-1中,酶切、测序鉴定获得重组质粒。将重组质粒转化E.coli BL21,异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生GST-SUMO3的融合蛋白,并纯化获得相对分子质量为38 000的融合蛋白。结果:通过BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,确定了重组质粒pGEX-4T-1/SUMO3中包含有312bp的小片段,并测序鉴定该插入片段序列与SUMO3序列一致;在终浓度为0.1mmol·L-1的IPTG诱导时,GST-SUMO3的融合蛋白也被成功地表达和纯化。结论:成功地制备和纯化了类泛素化修饰蛋白SUMO3/GST融合蛋白,为SUMO3多克隆抗体的制备提供了抗原基础,同时也为SUMO3及SUMO第二类家族功能的深入研究提供了保证。

人SMAD4全长及剪接体在HEK-293T细胞中的亚细胞定位及转录活性分析

为了观察人SMAD4全长及剪接体在HEK-293T中的亚细胞定位,并分析它们在HEK-293T细胞中的转录活性差异,将SMAD4全长及剪接体的pEGFP-C1重组质粒转染至HEK-293T细胞中,在荧光显微镜下观察含GFP标签的SMAD4全长及其剪接体蛋白的亚细胞定位,并通过双荧光素报告酶实验在HEK-293T细胞中对SMAD4全长及其剪接体激活SBE报告基因的情况进行比较。亚细胞定位观察显示,与pEGFP-C1空载组中GFP在HEK-293T中呈现核质均匀分布不同,GFP-SMAD4和GFP-SMAD4△4、GFP-SMAD4△6、GFP-SMAD4△5-6、GFP-SMAD4△4-6、GFP-SMAD4△4-7五种剪接体均分布于HEK-293T的细胞质中;而GFP-SMAD4△3则主要分布于HEK-293T的细胞核中。双荧光素酶实验结果显示,与空载组相比,在6种剪接体过表达组中,只有SMAD4△3过表达组能对SBE报告基因的荧光素酶活性起到一定的上调作用;但与SMAD4△3过表达组比较,SMAD4全长过表达组能对SBE报告基因的荧光素酶活性起到更明显的上调作用。本文观察了人SMAD4全长及剪接体在HEK-293T中的亚细胞定位,并分析了其对下游信号通路的转录激活情况,可为后续SMAD4剪接体蛋白的功能研究提供一定的基础。

SENP3在疾病发生发展中作用的研究进展

小泛素样修饰蛋白(SUMO)特异性蛋白酶(SENP)能介导SUMO前体加工和去SUMO化修饰,是细胞内SUMO稳态维持的核心调控因子。SENP3是SENP家族成员之一,分布于核仁并优先催化靶蛋白的去SUMO2/3修饰;通过与靶蛋白结合并去SUMO化靶蛋白调节多种胞内蛋白功能。一旦SENP3的表达异常,便会引发一系列细胞异常活动,最终导致疾病的发生发展。本文对SENP3在疾病中的功能研究进展做一综述。