非编码RNA：支架内再狭窄治疗策略的新靶点

冠心病(CAD)近年来发病呈年轻化趋势,已成为威胁人类健康的主要疾病之一。经皮冠脉介入手术(PCI)是目前主要的治疗方法。然而,支架作为一种外源性物质,会引起血管平滑肌细胞增殖、炎症反应、免疫反应和新生内膜形成,进而导致支架内再狭窄(ISR)和晚期血栓形成,严重影响冠心病支架植入患者预后。非编码核糖核酸(ncRNAs)是不翻译蛋白质的RNA,研究表明其在调节内皮细胞、平滑肌细胞功能及炎症反应方面具有巨大的潜力。本文概述了不同类型的ncRNAs在支架内再狭窄过程中的调控作用,并提出ncRNAs可作为支架内再狭窄治疗的新靶点。

骨髓间充质干细胞源外泌体对大鼠颈动脉球囊损伤后circRNA和microRNA差异表达的影响

目的骨髓间充质干细胞(BMSCs)能够在多种心血管疾病病理过程中发挥重要作用,但其对支架内再狭窄的影响有待进一步研究。文中旨在探讨BMSCs源外泌体对大鼠颈动脉球囊损伤后新生内膜增殖的影响及circRNA和microRNA表达变化。方法采用差速超速离心法提取大鼠BMSCs源外泌体,并使用Western blot及透射电镜对其进行鉴定。采用球囊损伤大鼠颈动脉的方法建立血管内膜增生动物模型,将36只成年雄性SD大鼠随机分为:假手术组、损伤组、外泌体组(400μL);假手术组大鼠只分离颈左总动脉血管,其余各组大鼠的左颈总动脉均行球囊损伤,外泌体组行球囊损伤后立即原位注射400μL BMSCs源外泌体并用微型血管夹夹闭血管5 min。采用HE染色检测内膜增生情况,DCFH-DA染色检测血管活性氧(ROS)释放情况。采用circRNA和microRNA芯片筛查差异表达的circRNA和microRNA,并以每组3个样本对其中显著差异的8个circRNA和7个microRNA进行qRT-PCR验证,并筛选出BMSCs源外泌体处理后差异表达的circRNA和microRNA;生物信息学方法预测差异microRNA的靶基因,并进行GO分析和KEGG通路分析,构建circRNA-microRNA-mRNA共表达网络,对其潜在分子机制进行探讨。结果透射电镜及Western blot验证提取的囊泡状物质为外泌体;HE染色结果显示:损伤组较假手术组新生内膜增殖明显,其内膜/中膜面积比(1.902±0.217)较假手术组(1.000±0.000)显著增加(P<0.05);外泌体组较损伤组新生内膜增殖程度有所减低,其内膜/中膜面积比(0.982±0.067)较损伤组明显减低(P<0.05)。DCFH-DA染色结果显示:与假手术组DCFHA红色荧光强度(4.730±0.104)相比,损伤组(16.800±0.380)明显增强(P<0.05);与损伤组相比,外泌体组DCFHA红色荧光强度(12.810±0.094)明显减弱(P<0.05)。circRNA芯片显示差异性表达的circRNA共1683个(Fold change≥2,P<0.05)。与假手术组相比,损伤组中上调的有631个,下调的有1052个。microRNA芯片显示有差异microRNA共44个(Fold change≥2,P<0.05),且均在损伤组上调。GO分析和KEGG分析表明,microRNA的预测靶基因参与了细胞生物学进程正向调控、细胞间紧密连接、激酶活性等方面有关,并在MAPK信号通路、Ras信号通路、Hippo信号通路等等中富集。结合芯片和qRT-PCR结果,筛选出BMSCs源外泌体处理后损伤颈动脉组织中差异表达明显的有circRNA_004976、circRNA_008565、circRNA_017449以及miR-20a-5p、miR-146a-5p、miR-21-5p(P<0.05)。结论BMSCs源外泌体可以抑制大鼠颈动脉球囊损伤后内膜增生,其潜在机制可能与circRNA_004976、circRNA_008565以及miR-20a-5p、miR-21-5p等分子调控细胞增殖、迁移有关。

骨髓间充质干细胞源外泌体对大鼠颈动脉球囊损伤后lncRNAs表达的影响

目的探讨骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)源外泌体(exosomes)对大鼠颈动脉球囊损伤后内膜增生的调控作用及其长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)表达的影响。方法采用差速超速离心法提取大鼠BMSCs源外泌体,并通过Western blot和透射电镜对其进行鉴定。SD大鼠分为3组:(1)假手术组(只分离左颈总动脉血管);(2)损伤组(左颈总动脉采用球囊损伤);(3)外泌体组(建立大鼠颈动脉球囊损伤模型后原位注射0.25μg/μL外泌体400μL),14 d后采用HE染色观测颈动脉内膜/中膜面积比(intima/media,I/M)、免疫组化检测PCNA表达、Western blot检测血管内膜增殖及表型转化相关指标的变化。采用lncRNA-mRNA共表达谱芯片表达变化及其生物信息学分析筛查假手术组和损伤组大鼠颈动脉组织中差异表达的lncRNAs和mRNAs,对其潜在分子机制进行探讨。采用qRT-PCR检测各组颈动脉组织中候选lncRNAs的表达。结果电镜结果显示BMSCs源外泌体呈现"茶杯垫样"改变,Western blot结果显示所提取的外泌体中CD63、Alix、HSP70蛋白表达阳性。与损伤组相比,经BMSCs源外泌体处理后大鼠颈动脉I/M显著减少(P<0.05),增殖相关蛋白PCNA、Cyclin D1表达下调(P<0.05)。lncRNA-mRNA共表达谱芯片检测结果,与假手术组相比,损伤组有1083个lncRNAs表达上调,629个lncRNAs表达下调,2004个mRNAs表达上调,2487个mRNAs表达下调(Fold Change>2.0,P<0.05)。GO和KEGG通路分析结果显示,多条lncRNAs与mRNAs相互关联,通过调控相应的靶mRNAs,参与血管平滑肌收缩、肌动蛋白细胞骨架调节和细胞周期等多种生物学过程,与球囊损伤后血管再狭窄的机制有关。结合生物信息学分析,采用qRT-PCR检测3组大鼠颈动脉组织中上述差异性表达最为显著的7个lncRNAs,结果表明,与损伤组相比,外泌体组XR593268上调(P<0.05),XR602080、XR602012、XR591017均下调(P<0.05)。结论BMSCs源外泌体抑制大鼠颈动脉球囊损伤后内膜增生,其潜在机制可能与XR602080、XR591017通过Gsk3b、Cdkn2b、Ccna2等分子调控平滑肌细胞周期变化有关。

过表达LncRNA LOC100360491对缺氧复氧诱导H9c2心肌细胞凋亡的影响

目的观测长链非编码RNA(long noncoding RNA,LncRNA)LOC100360491(后简称LOC100360491)对缺氧复氧诱导的H9c2心肌细胞凋亡的影响,探讨其潜在作用机制。方法(1)通过慢病毒转染大鼠H9c2心肌细胞构建过表达及抑制LOC100360491的心肌细胞系,分为4组:空白对照组、过表达LOC100360491组、抑制LOC100360491组及空载体组,qRT-PCR检测各组LOC100360491的表达。(2)将慢病毒转染的大鼠H9c2心肌细胞进行缺氧24 h复氧6 h处理以观察LOC100360491对该细胞凋亡的影响,分为5组:空白对照组、缺氧复氧组、过表达LOC100360491组、抑制LOC100360491组及空载体组。采用流式细胞术检测各组细胞凋亡早期磷脂酰丝氨酸外翻与凋亡中期线粒体活性氧释放情况;Western blot检测各组细胞中凋亡效应蛋白procaspase3、cleaved-caspase3、促凋亡蛋白Bax及抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。(3)采用qRT-PCR检测各组PAK3及CNNM2基因的表达以探讨LOC100360491的潜在调控机制。结果(1)qRT-PCR结果显示:与空载体组相比,过表达LOC100360491组LOC100360491表达显著上调(P<0.05),抑制LOC100360491组LOC100360491表达显著下调(P<0.05)。表明细胞系构建成功。(2)流式细胞术及Western blot结果显示,与缺氧复氧组相比,过表达LOC100360491组H9c2细胞早期凋亡、活性氧的释放均显著下降(P<0.05),cleaved-caspase3、Bax表达显著下调,Bcl-2表达显著上调(P<0.05);而抑制LOC100360491组则与之相反,但差异无统计学意义。(3)qRT-PCR结果显示:与空白对照组相比,过表达LOC100360491组PAK3表达显著上升(P<0.05),而CNNM2则无明显变化(P>0.05)。抑制LOC100360491组PAK3及CNNM2表达显著下降(P<0.05)。结论LOC100360491可通过线粒体活性氧途径抑制缺氧复氧诱导的大鼠H9c2心肌细胞凋亡的发生,可能与其在转录水平上调控PAK3的表达有关。