弓形虫多表位基因重组抗原在弓形虫免疫检测中的应用

目的评价弓形虫多表位基因重组抗原在弓形虫感染诊断中的效果,探索多表位抗原在弓形虫免疫检测中的应用前景。方法以Ni-NTA Agarose和割胶电渗两步纯化法,获取弓形虫多表位基因的原核表达纯化产物rMAG,以适宜浓度的rMAG包被ELISA微孔板,分别检测弓形虫急性和慢性感染血清,评价试剂盒检测的敏感性和特异性。结果经Ni-NTAAgarose和割胶纯化,得到了纯度为95.86%的弓形虫多表位重组可溶性抗原。以3!g/ml的抗原浓度包被ELISA微孔板,对兔和小鼠的急慢性弓形虫感染血清进行了检测。结果检测小鼠血清141份,其中慢性感染弓形虫小鼠血清117份、正常小鼠血清24份,检测体系的敏感性为88.88%,特异性为91.67%,一致性为89.36%。检测兔血清24份,其中急性感染弓形虫兔血清18份,正常兔血清6份,阳性血清检出率为94.4%,总一致性为91.5%。结论以弓形虫多表位重组抗原构建的ELISA试剂盒既可以检测弓形虫急性感染血清,又可以检测弓形虫慢性感染血清,具有一定的应用前景。

全身复合麻醉在动物实验中的应用研究

目的研究动物实验中的最佳麻醉方法。方法针对不同实验动物,选用不同药物,采取不同的麻醉方法,对实验动物进行复合麻醉,综合判断麻醉效果。结果将盐酸氯胺酮、速眠新和安定三者以4∶2∶1(体积比)的比例混合进行静脉复合麻醉,麻醉效果最为理想;对犬、猫和猪,以静肌复合麻醉效果最为理想;抗胆碱药阿托品作为辅助麻醉药物,能有效地预防麻醉过深的发生。结论对实验动物进行合理的复合麻醉能达到理想的麻醉效果。

弓形虫多表位基因的构建及其在大肠杆菌系统中的表达鉴定

目的 构建弓形虫和破伤风毒素多个表位的编码基因 ,将其在大肠杆菌系统进行表达 ,评价重组抗原的特异反应性。方法 从弓形虫保护性抗原及通用免疫增强佐剂破伤风毒素中选取含有T和 (或 )B细胞表位的抗原片段 ,通过软件分析在各片段之间插入适当数目、起间隔作用的氨基酸 ,以保持个片段的空间构象独立性 ,从而确定氨基酸顺序。根据氨基酸序列选取适当的密码子构成弓形虫多表位基因。将该基因合成并鉴定后 ,亚克隆入原核表达载体 ,在大肠杆菌中表达并分析表达产物的表达形式和抗原活性。结果 成功构建了长度为 36 0bp的弓形虫多表位基因。该基因在原核表达系统中经诱导 ,得到了 14 4kDa的包涵体形式的表达产物。免疫印迹实验表明该产物具有强特异性抗原活性。

具有免疫反应性的弓形虫多表位抗原在大肠杆菌中的可溶性表达和鉴定

目的获得弓形虫多表位基因在原核系统中可溶性表达产物,为弓形虫病重组抗原试剂盒的制备及疫苗的研究奠定基础。方法以PCR法扩增弓形虫多表位基因,使其两端带有与载体pET32a相匹配的酶切位点,插入载体pET32a,酶切并测序鉴定后,转入大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG进行诱导,SDS-PAGE分析和鉴定该基因的表达水平、表达产物的可溶性及其相对分子质量,Western-blot分析表达产物的免疫反应性。结果该基因在原核表达系统中经诱导,得到了Mr31000的可溶性融合表达产物。经Ni-NTA纯化,纯度可达90%以上。免疫印迹实验表明该产物能够被弓形虫B36感染的小鼠血清和弓形虫RH感染的兔血清特异识别。结论弓形虫多表位基因在原核中的可溶性表达产物在弓形虫病诊断及疫苗研究中有潜在的应用价值。

弓形虫多表位抗原基因DNA疫苗对BALB/c小鼠的免疫保护性研究

目的以弓形虫多表位抗原基因DNA疫苗免疫小鼠,评价该疫苗对弓形虫感染产生的免疫保护作用。方法利用PCR技术和亚克隆技术,构建弓形虫多表位抗原基因真核表达重组质粒pcDNA3-MAG,以质粒纯化试剂盒大量制备质粒,同时分别以载体质粒pcDNA3和PBS液为空质粒对照和空白对照,与lipofectin按5∶2的比例混合后,经股四头肌注射免疫小鼠,间隔两周,连续免疫3次,通过检测小鼠血清中特异的IgG抗体、IFN-γ和IL-4含量,评价疫苗产生的体液免疫和细胞免疫水平。以强毒型RH株弓形虫感染免疫小鼠,统计小鼠的存活时间,评价疫苗产生的免疫保护性。结果经双酶切及DNA测序鉴定,所构建的重组质粒pcDNA3-MAG读码框架正确。与免疫前及载体质粒和空白对照组相比,小鼠免疫后产生特异性IgG抗体,并引发高水平IFN-γ。攻虫后,实验组较对照组小鼠存活时间明显延长。结论弓形虫多表位抗原基因DNA能诱导BALB/c系小鼠产生特异的细胞免疫和体液免疫,对弓形虫感染可产生一定的免疫保护性。

弓形虫表观遗传学研究进展

弓形虫复杂的生活史包含多个生命阶段、多种宿主和多种生存环境,从一个阶段向另一个阶段的转换,对外部环境的适应,均需要精密的基因表达调控机制。生物信息学分析表明,弓形虫缺乏其他真核生物典型的转录因子,却存在着丰富的表观遗传学机制。相关研究证明,弓形虫在转录后水平存在着以组蛋白修饰为主的大量修饰机制,如乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化和类泛素化等;同时发现弓形虫非编码RNA在弓形虫的基因表达调控中发挥了重要作用。这些结果为进一步揭示弓形虫的致病机制,从而有效防治弓形虫感染提供了可靠依据。

弓形虫感染实验动物模型的特点及建模方案的选择

弓形虫感染对人类生活和畜牧业发展构成严重威胁。弓形虫感染实验动物模型是进行弓形虫学相关研究的基础条件之一。在实际研究工作中,根据不同的实验目的、选取不同的实验动物和以不同的实验方法所建立的实验动物模型,呈现出复杂和多变的特点。这一方面可以满足不同实验的需要,但同时也在实验结果的评价上导致一定程度的不足。根据弓形虫感染实验动物模型的不同特点,针对特定的实验目的,选择适合方法建立适合的实验动物模型,是进行相关弓形虫学研究的有效基础和前提。

加强医院实验动物管理 促进科研型医院建设

实验动物工作是医学发展的重要支撑条件。阐述了医院实验动物工作的职能特点、所承担的工作任务,介绍了本院实验动物工作的做法和取得的成效,提出了进一步加强医院实验动物管理、促进科研型医院建设的建议。

弓形虫速殖子和缓殖子相互转换机制的研究进展

弓形虫在中间宿主内以速殖子和缓殖子两种滋养体形式存在。其机会性致病与速殖子和缓殖子之间的互相转换密切相关,揭示此转换机制将有助于寻找更有效的途径以控制弓形虫的急性和慢性感染。本文刈近年来有关这种转换机制的研究进展加以综述。

弓形虫多表位基因植物表达载体的构建

目的 构建弓形虫多表位基因(TGMG)植物表达载体。方法①将TGMG亚克隆人pBAC55构建中间载体pB35MG,再将其中E35S/TGMG/NOS3′结构单元亚克隆人pCAMBIA2300构建植物表达载体pC35MG。②将番茄果实特异性启动子E81.1插入pB35MG构建中间载体pB35E1MG,再将其中E35SE81.1/TGMG/NOS3′结构单元亚克隆人pCAMBIA2300构建植物表达载体pC35E1MG。③将番茄果实特异性启动子E82.2插入pB35MG构建中间载体pBE2MG,再将其中E82.2/TGMG/NOS3′结构单元亚克隆人pCAMBIA2300构建植物表达载体pCE2MG。测序鉴定pB35MG、pC35E1MG、pCE2MG中的TGMG序列。④pC35MG、pC35E1MG、pCE2MG转化根癌农杆菌LBA404。结果 重组质粒用酶切鉴定均得到预期片段,pB35MG、pC35E1MG、pCE2MG测序结果正确。结论 成功构建TGMG中间载体pB35MG、pB35E1MG、pBE2MG,以及植物表达载体pC35MG、pC35E1MG、pCE2MG。并将3种植物表达载体导入根癌农杆菌。

湿热环境下密闭性功能敷料对伤口细菌学定量的影响

目的 研究湿热环境下密闭性功能敷料对创伤伤口的抗菌作用。方法 模拟湿热环境 ,以猪创伤为实验模型 ,常规处理为对照组 ,密闭性功能敷料为实验组 ,观察伤口细菌数量的变化和伤口大体情况。结果 实验组的细菌数量增长显著低于对照组 (P <0 .0 1) ,且热暴露后 (损伤后 2 4h)仍未达到感染阈值。伤口外观显示对照组损伤后 2 4h出现感染征象。

常用实验动物的麻醉

对实验动物的麻醉是动物实验中至关重要的一环。本文从麻醉药物的选择、麻醉途径的选择、麻醉深度的把握及麻醉后的监护等方面 ,阐述了对常用实验动物的麻醉原则、方法及注意事项。

适当比例的DNA:脂质体混合物能显著增强DNA疫苗的免疫效果

目的 探讨脂质体能否加强DNA疫苗的免疫效果。方法 本文应用一系列具有不同比例的编码弓形虫主要表面抗原的质粒DNA :脂质体混合物免疫小鼠 ,并对不同组小鼠的抗体产生情况进行了分析比较。结果 不同组小鼠的特异抗体滴度有很大不同 ,只有一定比例的DNA :脂质体混合物才能有效激发体液免疫 ;适量比例的DNA :脂质体混合物能提高特异抗体的滴度、提前特异抗体出现的时间 ,还能大大降低DNA的用量。本研究尚揭示 ;一定量的DNA对于有效免疫的激发是必需的 ,但并不是越多越好。加强注射可以增加免疫反应性 ,但 3次以上似乎没有必要。结论 适量比例的DNA

弓形虫SAG1基因在大肠杆菌中的高效表达及重组抗原对弓形虫感染的检测

目的 在原核系统中高效表达弓形虫表面抗原SAG1并利用重组抗原检测弓形虫感染。方法 将截短的SAG1基因经PCR扩增后，定向亚克隆入原核表达载体pET-30a(+），酶切鉴定出阳性重组子并经序列测定证实读码框正确，将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，以IPTG诱导表达, 对融合的表达产物进行纯化和复性，通过免疫印迹和ELISA实验检测其特异的免疫反应性。结果 成功构建截短型SAG1在原核系统中的重组表达质粒，并以融合蛋白的形式在大肠杆菌中得到了高效表达，其表达量占细菌裂解液中总蛋白量的31.58%。经过简易的纯化和复性过程，该重组抗原（rSAG1）能被弓形虫感染的人血清所识别。用rSAG1构建的ELISA试剂盒对弓形虫病的检测具有高度的敏感性和特异性。结论 截短型SAG1在大肠杆菌中得到了高效表达，重组抗原经纯化和复性后，能有效检测弓形虫的感染，可用于构建弓形虫病检测试剂盒。

浅谈实验动物安乐死

在动物实验过程中或结束后,通常会为免除或减轻动物痛苦、节约动物饲养成本、获取精确的实验数据等原因,对实验动物施行安乐死。实施实验动物安乐死,应当由经过伦理道德、技术和心理培训的人员选择适当的仁慈终点,根据动物的品种、年龄、数量、身体状况及实验目的选择最合适的安乐死方法,使动物在无痛苦的状态下迅速失去意识,直至死亡。

我国实验动物伦理委员会建设的现状及问题分析

我国动物实验的伦理审查工作在不断地进步,但大多数实验动物伦理委员会还存在管理不规范、人员培训缺乏、资金投入不足、监管不力等方面的问题。对我国实验动物伦理委员会的建设现状和存在的问题进行了分析,并对如何加强我国实验动物伦理委员会建设提出了一些建议。