通过融合双亲短肽改善L-天冬酰胺酶酶学特性

L-天冬酰胺酶可以将L-天冬酰胺水解成L-天冬氨酸与氨,主要应用在医药与食品行业。作者尝试在L-天冬酰胺酶N-末端融合不同的自组双亲短肽,改善该酶的酶学特性。首先,利用分子克隆技术将6条分别具有不同特征的短肽与L-天冬酰胺酶的N-端融合,并在Escherichia coli BL21中进行表达,最后,利用Ni^(2+)-NTA纯化获得纯的重组L-天冬酰胺酶酶液。结果表明,融合SAP4对L-天冬酰氨酶(ans Z酶)动力学特征影响较大,融合蛋白SAP4-ans Z的比活力较融合前提高约30%,其中重组蛋白K_m值较原始酶下降了7.5%,而V_(max)值得提升了10%,说明融合SAP4可以改善ans Z酶对L-天冬酰胺的水解效率。

一株转化4-羟基-2-丁酮为1,3-丁二醇微生物菌株的筛选及鉴定

从本实验室保藏的86株酵母菌株中筛选到20株利用4-羟基-2-丁酮(4H2B)生产1,3-丁二醇(1,3-BDO)的菌株,当转化液中4H2B浓度为10g/L时,经初步测定1,3-BDO含量,其中菌株32 1,3-BDO产量最高达6.5g/L,具有较好的1,3-BDO生产潜力。对其进行形态学和常规生理生化鉴定实验,并结合18S rDNA基因分析,比对结果表明,菌株32与Pichia farinosa strain DC 3343相似性达99.8%,为Pichia farinosa的一个亚种。

高效转化L-谷氨酸为γ-氨基丁酸菌株的筛选、鉴定及初步优化

从发酵食品及自然界中筛选出能利用L-谷氨酸生产γ-氨基丁酸的菌株,并对转化条件进行初步优化。采用乳酸菌分离纯化的方法分离出乳酸菌,再通过初筛、复筛挑选出高产γ-氨基丁酸的菌株,并对其进行形态学、常规生理生化鉴定及16S rDNA基因分析,随后对菌株产γ-氨基丁酸的转化条件进行初步优化。根据常见细菌系统鉴定手册,所筛菌株初步确定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。优化后的最佳转化条件为:菌株菌龄为36 h、缓冲液初始pH为4.8、缓冲液浓度为0.2 mol/L。在优化后的转化条件下,添加5 g/dL底物转化24 h,转化率最高可达97.81%,转化液中γ-氨基丁酸的质量浓度达34.26 g/L,该菌种可作为γ-氨基丁酸产生菌,具有较好的γ-氨基丁酸生产潜力。

定点突变提高枯草芽孢杆菌L-天冬酰胺酶的活力及稳定性

L-天冬酰胺酶可以催化L-天冬酰胺转化为L-天冬氨酸和氨。它可以通过降解食品原料中的L-天冬酰胺而降低高温烹制食品中丙烯酰胺的含量。由于食品预处理环境的复杂性,只有具有高酶活且稳定的酶才能满足食品生产中的应用。作者通过点突变提高来源于Bacillus subtilis B11-06的L-天冬酰胺酶(Bs AII)的酶活和热稳定性。通过序列比对和同源模拟选择5个点进行突变,构建6个突变菌株。酶活测定结果表明,突变体酶S299N_(ansz)和P348A_(ansz)的酶活较Bs AII分别提高28%和32%。其中P348A_(ansz)的热稳定性和p H稳定性较Bs AII均有明显提高。本研究表明,第299和348位氨基酸残基对酶的催化作用有较大影响,对该酶的催化机理的研究提供了一定的基础,并提高了该酶的工业应用潜力。

谷氨酸脱羧酶基因工程改造研究进展

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是一种具有重要生理功能的天然氨基酸,广泛应用在医药、食品、化工等行业。利用谷氨酸脱羧酶催化法合成GABA因其反应条件温、对环境友好和原料易得已成为当前研究的热点。该研究论述了催化合成GABA关键酶谷氨酸脱羧酶的分子改造、基因工程菌构建等研究进展。

理性设计定点突变提高Streptomyces kathirae SC-1酪氨酸酶热稳定性

利用SWISS-MODEL在线服务器以栗色浑圆链霉菌(Streptomyces castaneoglobisporus)酪氨酸酶(PDB登录号:2AHL)为模板对S.kathirae酪氨酸酶的3-D结构进行同源模拟。使用在线预测软件PoPMuSiC-2.1计算酪氨酸酶每个突变氨基酸的去折叠自由能变化(ΔΔG)来辅助设计提高酪氨酸酶的稳定性,利用定点突变构建突变体,并且在大肠杆菌中对野生型酪氨酸酶及突变体进行表达,最终获得了两个热稳定性提高的突变体R95Y、G123W。在此基础上进行复合突变,获得了一个热稳定性显著提高的突变体R95Y/G123W。该突变体在60℃的半衰期提高了2.43倍,最适反应温度由45℃提高到50℃,本研究所用的基于蛋白质结构的理性设计提高稳定性的策略也可以应用于其他工业酶类,显示了良好的应用前景。

点突变H125L和E145A对L-天冬酰胺酶酶活和热稳定性的改善

L-天冬酰胺酶可以催化L-天冬酰胺转化为L-天冬氨酸和氨。目前,已被广泛应用于食品和医药行业,但是由于低酶活、稳定性差等缺陷限制了该酶的应用。研究通过理性设计选择了7个位点进行点突变,以提高来源于Bacillus subtilis B11-06的L-天冬酰胺酶(Bs AII)的酶活和热稳定性。酶活测定结果表明,突变体酶H125Lansz、E145Aansz、H125L-E145Aansz的酶活较Bs AII分别提高36%、48%和64%,突变体酶E74Gansz酶活为BSAII的35.73%,H139ansz酶活几乎为0,其余突变体酶酶活较BSAII均有所降低。其中H125Lansz在40℃的半衰时间较BSAII延长3.9 h。研究表明,第125和145位氨基酸残基对酶的催化作用和蛋白结构的稳定性有较大影响,为其他来源L-天冬酰胺酶的改造提供了理论依据,并提高了该酶的工业应用潜力。

微生物遗传育种学教学策略创新

为进一步提高微生物遗传育种学课程教学质量,激发学生的专业兴趣,文章从模块化教学方法、创新教学模式、多元化授课形式等方面探讨了该课程教学改革的必要性,阐述了对微生物遗传育种学课程融入思想政治教育的思考,讨论了如何为国家与社会培养出综合素质全面和具有创新能力以及国际化视野的综合型人才,为相关本科专业的教学改革实践与应用提供借鉴。

宁夏食品和生物发酵产业发展研究

食品和生物发酵产业是关乎国计民生的基础与战略性新兴产业,该产业的健康发展与公众的膳食营养、饮食安全、人口健康以及社会经济可持续发展息息相关。近年来,宁夏食品与发酵产业发展迅速,已成为消费品工业中与农业依存度最大、与其他行业关联度最大、吸纳城乡就业最多的产业门类之一。本文在全面分析该产业发展现状、产业技术供给与需求状态的基础上,聚焦产业链建设尚不完善、产业发展方式较为粗放、产品同质化程度较高、研发力量与技术创新平台偏弱等制约因素,提出了优先发展的重点产业、重点方向和关键支撑措施。

连续离子交换法分离发酵液中的L-精氨酸

相比传统的固定床离子交换提取工艺,连续离子交换工艺分离发酵液中L-精氨酸具有连续、稳定、高效等优点。钝齿棒杆菌是1株具有自有知识产权的高产L-精氨酸工业用菌株,产量达74.5 g/L。该研究通过静态吸附及解吸实验,筛选得到最优树脂D155,可在30 min内达到吸附平衡,平衡吸附量达121.31 mg/g。通过固定床实验,确定了最佳进料流速为6 mL/min,穿透时间为29 min,半饱和时间为59 min,饱和时间86 min,穿透吸附容量为134.7 mg/g,半饱和吸附容量为193.8 mg/g,饱和吸附容量为261.2 mg/g,为最佳洗脱剂为2 mol/L的氨水,洗脱率为97.14%。通过30柱连续离子交换实验,确定了交换区、交换后水洗区、洗脱区、洗脱后水洗区、顶水区最佳进料流速分别为6、6、5、10、3 mL/min。在各区最佳进料流速下,各出口浓度呈周期性变化。该工艺提高了L-精氨酸分离工艺的连续性、稳定性及分离效率,有效地降低了分离过程中的耗水量、耗碱量及劳动力投入,为发酵生产L-精氨酸提供了更科学有效的分离工艺。

过量表达枯草芽孢杆菌乙偶姻还原酶提高2,3-丁二醇产量

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168是一株安全生产的菌株,但是在2,3-丁二醇(2,3-BD)的发酵过程中,会积累较多的副产物乙偶姻(AC)。乙偶姻还原酶是催化AC合成2,3-BD的关键酶。为了提高2,3-BD合成效率,首先将乙偶姻还原酶基因acr克隆到B.subtilis 168,构建了重组菌B.subtilis 168/p MA5-acr。对重组菌进行摇瓶发酵实验,结果表明,相比出发菌,重组菌的2,3-BD产量和转化率分别提高28.62%和22.87%,主要副产物AC积累量下降了20.01%。同时,分支路径的副产物甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸,也有不同程度的降低。

赖氨酸脱羧酶分子改造及其催化合成戊二胺

1,5-戊二胺(戊二胺)具有良好的生物活性,广泛应用在农业、医药以及工业等领域。赖氨酸脱羧酶可以催化L-赖氨酸生产戊二胺,为了提高赖氨酸脱羧酶催化合成戊二胺的效率,首先在大肠杆菌中克隆表达了粘质沙雷氏菌来源的赖氨酸脱羧酶(SmcadA)。生化特征表明,SmcadA最适催化pH为6.0,最适催化温度约为40℃。随后对SmcadA的第348位氨基酸进行了突变研究,筛选获得了催化效率显著提高的突变体Gly348Ala,主要原因是该突变导致蛋白中氨基酸残基和底物之间相互作用的氢键数增加,从而影响其催化效率。最后,对重组菌株细胞进行了戊二胺合成研究,催化反应25 h,含有突变体Gly348Ala的重组菌细胞可以催化合成218.2 g/L戊二胺,野生型SmcadA重组菌仅能催化合成159.2 g/L戊二胺。该研究结果为工业化酶催化合成戊二胺提供了借鉴。

从植物乳杆菌全细胞转化液中分离纯化γ-氨基丁酸的工艺研究

前期筛选获得1株高效转化L-谷氨酸为γ-氨基丁酸(GABA)的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GB01-21,该菌以浓度200 g/L的L-谷氨酸为底物,发酵20 h左右,能以99%的摩尔转化率生产γ-氨基丁酸,产物γ-氨基丁酸的终浓度可达140 g/L左右。从全细胞转化液中分离纯化γ-氨基丁酸,着重对脱色工艺进行了研究,考察了温度、时间、pH和活性炭添加量对脱色效果的影响。通过单因素实验的基础上的正交实验分析,确定了脱色最佳工艺条件为粉末活性炭(150～200目)用量为1.5%,脱色温度70℃,pH值4.0,脱色时间40 min,γ-氨基丁酸转化液的脱色率高达98.42%,γ-氨基丁酸的保留率可达97.23%。随后对γ-氨基丁酸转化液进行初步分离纯化,最终测得γ-氨基丁酸的回收率89.4%,纯度为96.7%。

重组酿酒酵母生物合成菜油甾醇

菜油甾醇作为甾体药物(孕酮、雄烯二酮、氢化可的松等)的重要合成前体已受到国内外研究学者的广泛关注。首先通过生物信息学分析,筛选了10种不同来源的7-脱氢胆固醇还原酶DHCR7,并采用CRISPR/Cas9基因编辑技术将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)内源的ERG5基因替换成不同来源的DHCR7基因,构建了菜油甾醇合成菌株。结果发现整合来源于Pangasianodon hypophthalmus DHCR7的菌株Zw507表现出最高的菜油甾醇的产量216.93 mg/L。进一步筛选了10种酵母内源启动强度较强的启动子来与PhDHCR7基因进行组合,结果显示以TEF1p为启动子时菜油甾醇的产量最高可达253.35 mg/L。为了进一步提高菜油甾醇产量,增加了DHCR7表达盒在酵母基因组上的拷贝数。当拷贝数为3个时,菜油甾醇的产量达到最高302.27 mg/L。最终,通过5 L发酵罐进行补料分批发酵,实现了916.88 mg/L菜油甾醇产量。该菌株可作为后续甾体药物生物合成的优良底盘细胞。

利用重组枯草芽孢杆菌产Bacillus pumilus来源的γ-谷氨酰转肽酶及其在L-茶氨酸合成中的应用

L-茶氨酸作为一种非天然氨基酸对人体健康具有多方面的功效,其作为食品饮品添加剂和制药原料的需求量日益增加。本文以安全菌株Bacillus subtilis 168作为宿主菌,表达生产B.pumilus来源的γ-谷氨酰转肽酶(GGT)。结果显示,该来源GGT成功在B.subtilis 168中实现了胞外分泌表达。最后,通过关键转化条件优化,并结合批次流加策略,该重组GGT能够在16 h催化合成50.8 g/L的L-茶氨酸,该结果可以和已报道的以大肠杆菌作为宿主菌表达GGT并催化合成L-茶氨酸的产量相媲美。

重组大肠杆菌全细胞催化合成4-羟基异亮氨酸

4-羟基异亮氨酸(4-HIL)是一种很有前景的药物,它具有促进胰岛素分泌、改善外周组织对胰岛素的抵抗性和调节血脂异常等作用,而L-异亮氨酸羟化酶(IDO)常用于4-HIL的生产。首先,克隆了苏云金芽孢杆菌来源的L-异亮氨酸羟化酶,实现了其在E.coli BL21(DE3)中的异源表达。其次,通过同源建模和蛋白质结构分析,本着将与底物氨基酸侧链结合的氨基酸残基从亲水性或长链疏水性结构突变成丙氨酸Ala的原则,对I156位点进行了定点突变,以增大底物结合口袋,扩宽底物通遒进而提高4-HIL的产量。最后,对野生酶及突变酶的酶学性质、突变酶的羟基化反应体系进行研究,在最优催化条件下,分批补料转化底物进行4-HIL的生产。酶学性质结果显示,野生酶及突变酶I156A的最适温度均为25℃,最适pH均为7.0;突变酶I156A比酶活比野生酶提高了1.9倍,L-ILe转化率提高了28%。羟基化反应体系的最优转化条件为:20 mmol/L L-ILe,20 mmol/Lα-酮戊二酸,8 mmol/L Fe^(2+),30 mmol/L抗坏血酸和HEPES(50 mmol/L,pH 7.0)缓冲液。在最优转化条件下,重组菌E.coli BL21/pET28a-ido^(I156A)进行分批补料转化底物,时间间隔为4 h,32 h后得到77.3 mmol/L 4-HIL,底物最高转化率98.35%e。

重组大肠杆菌表达17β-羟基类固醇脱氢酶全细胞催化合成宝丹酮的研究

宝丹酮作为一种重要的蛋白同化雄性激素类固醇,具有提升肌肉质量和耐力的功能。宝丹酮的传统合成方法是以1,4-雄烯二酮(ADD)为底物通过化学法合成,但过程复杂、污染严重。17β-羟基类固醇脱氢酶(17β-HSD)可催化甾体化合物C-17位点的氧化还原反应,实现ADD和宝丹酮的相互转化。本研究通过基因序列同源性分析,筛选到6种不同来源的17β-HSD基因并对其在大肠杆菌中进行异源表达。利用不同重组菌转化ADD合成宝丹酮,结果表明重组菌BL21/pET28a-HSDPy的ADD转化率最高,因此选择BL21/pET28a-HSDPy进行进一步研究。鉴定了重组菌的酶学性质并优化其全细胞转化条件。结果表明在生物量为36 g·L^-1、底物浓度为5.40 g·L^-1条件下,经过两次补料,获得了3.66g·L^-1宝丹酮,比优化前提高了4.1倍。而且在生物转化过程中未检测到副产物。为生物合成宝丹酮提供了可能。

一株联产L-精氨酸和聚羟基丁酸酯的重组钝齿棒杆菌的构建

Corynebacterium crenatum SYPA 5-5是一株用于L-精氨酸(Arg)生产的工业菌株。聚羟基丁酸酯(PHB)是在细菌内部形成的聚合物,将PHB代谢途径引入细胞内可影响胞内的全局代谢网络,实现联产PHB和相关化工产品如琥珀酸、L-谷氨酸和L-色氨酸等。采用基因工程技术,将来源于Ralstonia eutropha H16的PHB合成基因簇phb CAB导入到L-精氨酸生产菌株C.crenatum SYPA 5-5中,进行组成型表达,旨在获胞内产PHB、胞外产L-精氨酸的效果,对出发菌和重组菌分别进行5 L容积发酵罐实验,并对发酵相关参数进行测定分析。结果表明,由于PHB合成基因簇的导入,重组菌中PHB质量为细胞干质量的12.8%,实现了胞外产L-精氨酸、胞内产PHB的效果,并发现胞内PHB的积累对菌体生产L-精氨酸有一定的正向作用,发酵96 h,L-精氨酸的产量达到43.21 g/L,相比于出发菌提高了20%。

Pyrococcus yayanosii L-天冬酰胺酶在枯草芽孢杆菌中分泌途径的鉴定及其分泌能力的提高

食品安全(GRAS)菌株枯草芽孢杆菌由于其具有良好的分泌表达能力及易于基因工程操作等特性被广泛用作外源蛋白质的表达菌株。枯草芽孢杆菌中蛋白质的分泌大多依赖于信号肽介导的Sec分泌途径(General secretion pathway)和Tat分泌途径(Twin-arginine translocation pathway)。在本研究中,通过信号肽预测、蛋白质N端测序等手段发现来自于Pyrococcus yayanosii L-天冬酰胺酶在枯草芽孢杆菌中的分泌并不依赖信号肽,该酶通过非经典蛋白质分泌途径(non-classical protein secretion pathway)进行分泌。通过信号肽筛选,发现最适合该酶在枯草芽孢杆菌中表达的信号肽为Tat分泌途径信号肽SPphoD,并通过共表达分子伴侣PrsA的方式将该L-天冬酰胺酶的分泌量提高了72.11%。

定点突变提高过氧化氢酶热稳定性和催化效率

过氧化氢酶催化过氧化氢分解形成水和氧,主要作用是保护细胞免受活性氧(ROS)的损伤,尽管其在工业上被广泛使用,但因热稳定的不足限制了它的使用前景。本研究以Bacillus pumilus ML413来源的血红素过氧化氢酶(KatX2)为研究对象,采用定点突变技术提高其热稳定性及催化效率。利用PoPMuSiC algorithm软件计算并预测了其潜在突变位点的折叠自由能,根据预测的结果,选择了其中自由能最低的3个位点(K117V,K117I和K117M)进行突变。结果发现,对K117位点进行突变,可以有效提高KatX2的热稳定性,突变体K117V在60℃下半衰期比野生型KatX2提高38 min,催化效率较突变前提高31.7%。根据结构分析发现,该点突变并未改变KatX2的二级结构。突变体K117V具有良好的工业应用潜力。