低盐度可诱导鲈鱼胞浆型PEPCK基因表达

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸,是糖异生途径的第1个限速酶.本研究用SMARTRACE技术从鲈鱼肝脏中分离克隆了PEPCK基因的全长cDNA序列.该基因全长2215bp,包含1个123bp的5′非翻译区和217bp的3′非翻译区,开放阅读框为1875bp,编码1个由624个氨基酸组成的蛋白质,该蛋白理论分子量为69.1kD,等电点为5.87.氨基酸序列分析表明,与其它动物的胞浆型PEPCK相似性很高,与黑鲷为94.2%,与大西洋鲑为86.4%,与人为75.9%,而与该鱼线粒体型PEPCK氨基酸同源性只有70.6%.系统发育分析显示,该蛋白首先与其它动物的cPEPCK聚成一支,然后再与鱼类的mPEPCK成簇,认为该PEPCK属于胞浆型.同时用RT-PCR分析了PEPCK基因在10个组织中的表达,结果表明只有在肝脏、消化道和肾脏有较高的表达.将鲈鱼从盐度为25的海水转入盐度为12的海水48h后,肝脏和肾脏的PEPCK基因表达有增加.实验结果表明,本实验克隆的为鲈鱼胞浆型PEPCK,低盐度可诱导其表达.

鲈PPARγ基因的克隆、组织表达及其抗体制备

根据GenBank上其他物种的PPARγ基因序列设计兼并引物,从鲈肝脏cDNA中扩增得到鲈PPARγ基因cDNA序列1588bp,分析表明该基因的开放阅读框为1569bp,编码522个氨基酸,理论等电点6.06,分子量59.02ku。将鲈PPARγ氨基酸序列比对后发现与欧洲鲈同源性最高,为93.1%;与金头鲷的同源性为92.3%,与人同源性也达到为61.8%。用RT-PCR分析该基因组织表达模式,结果表明,鲈PPARγ主要分布于肝脏、鳃和脂肪组织。将鲈PPARγ开放阅读框1569bp序列克隆至原核表达载体pET-28a(+)构成pET-28a-PPARγ1569重组体,并转化大肠杆菌BL21(DE3),以终浓度1mmol/L的IPTG对其进行诱导表达4h,SDS-PAGE电泳分析表明,pET-28a-PPARγ1569菌株在66ku处有1条特异的蛋白带,Western-blotting检测表明该蛋白为鲈PPARγ融合蛋白。用镍离子亲和柱纯化的鲈PPARγ融合蛋白免疫小鼠得到其多克隆抗体。用间接ELISA法检测鲈PPARγ抗体的抗体效价约为1∶16000。实验结果为进一步研究鲈PPARγ蛋白的生物学特性及功能奠定了基础。

鲈鱼酰基辅酶A结合蛋白Acbp基因cDNA的克隆和诱导表达

酰基辅酶A结合蛋白(acyl-CoA-binding protein,ACBP)对长链脂酰基辅酶A(long-chainfatty acyl-CoA esters,LCACoA)有很高的亲和力,因而对LCACoA在细胞内的运输和利用过程起重要的作用。本文采用RACE技术从鲈鱼肝脏中克隆了Acbp基因的全长cDNA序列,该基因全长cDNA 679 bp,5'端和3'端的非翻译区分别为83 bp和326 bp,开放阅读框为270 bp。推测编码89个氨基酸,理论等电点为5.44,分子量为10.14 kDa。鲈鱼Acbp与青鳉鱼、银鳕鱼、大西洋鲑和人的同源性分别为87%、84%、78%和68%。用RT-PCR和实时定量PCR检测鲈鱼肌肉、心脏、眼、大脑、消化道、肾脏、脂肪组织、脾脏、鳃和肝脏等10种组织的Acbp基因的表达情况,结果表明,在肾脏和肝脏的表达量高,肌肉、眼睛和大脑中表达低。定量PCR检测表明鲈鱼肝脏Acbp的表达在饥饿时明显下降,胰岛素上调其表达,葡萄糖对其表达则没有影响。