人脐带间充质干细胞体外分化成骨细胞的研究

目的探讨人脐带源间充质干细胞(HUC-MSCs)定向诱导分化为成骨细胞的能力。方法人脐带经胶原酶和胰蛋白酶消化后于DMEM/F12培养基中培养,通过传代作纯化和扩增;采用倒置显微镜及电镜观察细胞形态,细胞计数绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞免疫表型及细胞周期;以含有成骨细胞诱导剂(地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸)的DMEM/F12培养基对传至第3代的细胞定向诱导分化为成骨细胞,并对诱导后细胞作成骨细胞检测。结果经酶消化后,细胞贴壁生长,主要呈"成纤维样",但体积较大、形状不规则、细胞质突起多,细胞核大而疏松,核仁明显;第1、3、5、7代细胞生长曲线基本相同;细胞表面表达CD105、CD90、CD44、CD29及CD13,不表达CD34、CD45、HLA-DR;培养至第4代的细胞约72.724%的细胞处G1期、S期的细胞仅占18.069%,第6代时G1期细胞约为83.875%、S期为9.606%左右;细胞经成骨细胞诱导分化后,细胞形态发生改变,线粒体明显增多,出现较多的基质小泡、髓样体和空泡状结构,碱性磷酸酶染色显示呈强阳性,茜苏红染色和Von-Kossa染色显示细胞有钙盐沉积并形成钙结节。结论人脐带中分离及培养扩增细胞具有MSCs的基本特性,具有分化为成骨细胞的能力。

体外纯化培养外周血来源的树突状细胞的研究

目的建立来源于外周血的树突状细胞(DCs)的纯化培养方法并观察DCs的形态及功能。方法以Fi-coll密度梯度离心法从正常人外周血中分离出外周血单个核细胞(PBMNC)后,用体外培养的手段,采用培养黏附法或经免疫磁珠筛选法,获得单核细胞;分别加入不同浓度的细胞因子(重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子重组人白介素4重组人肿瘤坏死因子α)诱导培养,培养12 d诱导出DCs;用光镜和电镜观察培养的DCs,用流式细胞仪检测DCs表面的细胞表型(CD80、CD83、CD86、CD1α、HLA-DR),MTT法检测DC对T细胞的刺激增殖效应。结果在体外诱导出外周血来源的成熟DCs,电镜和光镜分析表明具有DCs的典型形态,所培养的细胞表面高表达CD80、CD83、CD86、CD1α、HLA-DR,并具有刺激异基因淋巴细胞增殖的能力。结论应用外周血来源的单个核细胞,采用培养黏附法或免疫磁珠分选法分选出的单核细胞,细胞因子培养12 d可得到成熟正常的DCs。

CCK-8检测新鲜脐带组织中细胞活性的初步研究

目的探索采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂检测新鲜脐带不同大小与数量组织中细胞活性,选用合适的组织块大小与数量诱导培养间充质干细胞,以获得最佳的细胞数量与细胞活性。方法临床获取新鲜脐带加工处理剪切成1/8组织块大小,重量为(0.045±0.001)g,采用CCK-8检测试剂盒检测新鲜脐带组织块活性,对CCK-8试剂的剂量、加入试剂后孵育时间、脐带组织块剪切大小与数量等做了比较与分析,并在6孔板中加入3块不同脐带组织块大小(1/2组、1/4组、1/8组)诱导培养间充质干细胞,对3组生成的细胞数量和细胞活性做了实验研究。结果新鲜脐带组织块剪切成厚度为0.5 cm左右环形组织块的1/8组织块大小,重量为(0.045±0.001)g,24孔板内脐带组织放置3块,CCK-8试剂浓度为15%,于37℃下孵育7-8 h为检测新鲜脐带组织块活性的最佳检测条件;6孔板中加入3块不同脐带组织块大小(1/2组、1/4组、1/8组)诱导培养间充质干细胞,3组中培养生成的细胞活性无明显差异(P>0.05)。但3组中培养生成的细胞数量,其中1/8组与1/2组或1/4组相比,差异有统计学意义(P<0.01),且每克组织块生成的细胞数量最多。结论 CCK-8试剂盒可用于准确地评估新鲜脐带组织中细胞活性。

人外周血树突状细胞低温保存的优化研究

目的探寻冻存树突状细胞(DCs)优化的冷冻保护剂组合。方法配制含不同浓度二甲基亚砜(DM-SO)的3种冷冻保护剂组合,A组:5%DMSO+6%羟乙基淀粉(HES)+4%人血清白蛋白(HAS);B组:10%DMSO+40%FCS;C组:12%DMSO+40%FCS,比较3组冷冻保护剂对人外周血CD14+单个核细胞诱导产生的成熟树突状细胞(mDCs)的冻存效果:采用两步法将mDCs冻存于-80℃冰箱过夜后转移至-196℃液氮气相中放置24 h,再将冻存的mDCs复苏后继续培养,并检测、比较冻存前后DC的形态、存活率、细胞表型及其对同种异体T细胞刺激活性的差异。结果 3组不同组合冷冻保护剂冷冻保存的mDCs复苏后其存活的细胞的形态没有发生明显改变,仍保留其成熟表型,并具备对T细胞的刺激活性。结论 3种不同浓度的DMSO冷冻保存mDCs,5%DMSO+6%HES+4%HSA组合更适宜。

人脐带非酶解法培养MSCs的方法建立

目的建立从人脐带Wharton's jelly组织中直接培养间充质干细胞(MSCs)的方法。方法将人脐带切成5 cm左右的片段,纵向剖开,剔除血管,把富含Wharton's jelly组织的脐带面置于10 cm2塑料培养皿的培养面上,加入含20%FBS的LG-DMEM培养基连续培养10 d;移去脐带组织后,培养皿中的细胞继续培养至80%-90%融合。传代和扩增3代(次)后,以倒置光学显微镜观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞免疫表型及细胞周期,用含有成骨细胞诱导剂、脂肪细胞诱导剂对传代培养至第3代的细胞分别定向诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞,并对诱导后细胞用碱性磷酸酶检测试剂、Von-Kossa染色检测试剂和茜苏红染色试剂作细胞生物学检测。结果脐带组织在贴壁培养5 d,组织周围可见有少量细胞贴壁生长,主要呈"成纤维样",形状不规则,移去脐带组织后继续培养至14-15 d时,细胞达到80%-90%汇合;细胞表面表达CD73、CD105、CD90、CD44、CD29、CD71及CD13,不表达CD34、CD14、CD133、CD45、HLA-DR;培养至第4代时约72.724%的细胞处在G1期,S期细胞占18.069%,第6代时,G1期细胞约为83.875%、S期细胞仅为9.606%左右。细胞经成骨细胞诱导分化后,碱性磷酸酶染色显示呈强阳性,茜苏红染色和Von-Kossa染色显示细胞有钙盐沉积并形成钙结节;细胞经成脂细胞诱导分化后,油红O染色呈红色,显示胞浆内有大量甘油三酯的聚集。结论采用非酶解法从人脐带Wharton's jelly中分离及培养扩增的细胞具备MSCs的基本特性,具有分化为成骨细胞和脂肪细胞的能力。

负载卵巢癌冻融抗原对树突状细胞分泌细胞因子的影响

目的探讨负载卵巢癌冻融抗原对树突状细胞分泌细胞因子的影响。方法采用反复冻融法获得卵巢癌细胞株SKOV3细胞抗原,联合应用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、重组人白细胞介素-4和重组人肿瘤坏死因子-α,体外诱导人外周血CD14+单核细胞为成熟DCs并负载卵巢癌肿瘤抗原;采用ELISA法检测培养细胞上清液中分泌IL-12p70、IFN-γ和IL-10含量,评价非成熟DCs和成熟DCs以及肿瘤抗原负载DCs和未负载肿瘤抗原DCs激活的CTL分泌细胞因子的能力。结果联合应用重组人的GM-CSF、IL-4和TNF-α可在体外诱导出成熟DCs;经ELISA方法检测,不同状态下的DCs分泌IL-12p70、IFN-γ的量不同,成熟DCs较非成熟DCs有更强的分泌IL-12p70、IFN-γ的能力(P<0.05),负载抗原DCs激活的CTL较未负载抗原DCs激活的CTL有更强的分泌IL-12p70[(182.89±4.57)pg/ml和(99.76±5.42)pg/ml,P<0.01]和IFN-γ的能力[(102.11±5.95)pg/ml和(68.29±5.04)pg/ml,P<0.01]。而成熟DCs分泌IL-10的能力与非成熟DCs相比,差异无统计学意义(P>0.05)。负载抗原后DCs激活的CTL与未负载抗原DCs激活CTL上清液中IL-10的浓度相比,两者之间的差异无统计学意义(P>0.05)。结论细胞因子的分泌量受DCs的成熟状态及某些刺激信号的影响,卵巢癌冻融抗原是其刺激信号之一。

人脐带源间充质干细胞临床输注前的优化制备

目的探讨人脐带源间充质干细胞(HUC-MSCs)临床输注前制备成细胞悬液,细胞活性和细胞表面抗原的变化。方法第3～5代人脐带源间充质干细胞用0.25%胰蛋白酶消化处理,PBS洗涤5次,分别重悬于磷酸盐缓冲液(PBS)或含有50 U/ml肝素-PBS、100 U/ml肝素-PBS、200 U/ml肝素-PBS中,放置于4℃、22℃或37℃条件下,分别延长至1 h、2 h、3 h,检测细胞存活率和细胞表面抗原的变化。结果 HUC-MSCs收集后重悬于PBS中,在4℃条件下,随着在体外放置时间的延长,细胞的存活率在随之下降,但细胞存活率明显高于放置22℃、37℃条件下的细胞。将细胞收集后重悬于含有肝素的PBS溶液中,细胞既无聚集现象,而且随着肝素浓度的增加,细胞的存活率相对较高,体外短暂保存HUC-MSCs的效果较好。在含200 U/ml肝素的PBS溶液中,4℃条件下细胞放置3 h后经苔盼兰染色镜下计数可知,HUC-MSCs存活率可维持在(91.3±3.08)%,而且HUC-MSCs表面仍高表达CD105、CD73、CD44、CD90。结论临床输注前制备HUC-MSCs重悬于含200 U/ml肝素-PBS中在4℃条件下3 h内可供临床有效输注。

沈阳文化艺术中心工程非常态无序空间钻石体玻璃幕墙安装定位技术

沈阳文化艺术中心工程主体结构,主要由2个不规则的空间结构竖向叠在一起的钢筋混凝土空间结构体系及"悬挑+悬挂"BRPC缓粘结预应力的复杂三维空间混凝土结构体系组成。外部钢结构为大跨度非常态无序空间网壳结构。屋面幕墙为三维空间三角形多面体组成钻石体玻璃幕墙结构。介绍在非常态无序空间钻石体玻璃幕墙定位安装技术中,重点推行的数字化测量控制和模拟技术,将数字化测量控制和模拟技术贯穿于整个项目的实施阶段。

寒冷环境对大鼠血清中T_(3)T_(4)含量及鼠尾组织过冷特牲的影响

对13只寒冷环境(2~-8℃)和13只常温环境(15℃)下饲养的大鼠,在2个月进行三个方面的观察:(1)用放射免疫分析方法(RIA)测定血清中T_(3)、T_(4)的含量;(2)测定鼠尾组织过冷点和过冷时间;(3)测定实验前后大鼠体重的变化。结果发现:寒冷环境组比对照组体重减轻;T_(3)、T_(4)含量减少;过冷点升高和过冷时间缩短。

装配式建筑免拆快装系统一体化快速建造技术

从装配式建筑产品角度考量,产品的交付速度至关重要。结合某装配式公建项目中装配式免拆快装系统的应用实践,以一体化和系统化思维,系统形成装配式免拆快装系统的设计、加工、配送及装配一体化关键技术,并详细介绍装配工艺流程、免拆模楼板进场、组合成型钢筋制品堆放、楼板吊装及安装等工艺。通过实际工程检验,一体化快速建造技术的应用可有效提高施工效率和施工质量,为实现装配式建筑产品的快速交付创造条件。

装配式建筑组合成型钢筋制品一体化快速建造技术

结合某高层装配式住宅项目,从设计、加工、配送及装配等方面对装配式建筑组合成型钢筋制品一体化快速建造技术进行阐述,并详细介绍了该技术的装配流程与质量控制要点。该一体化快速建造技术能实现组合成型钢筋制品的大规模工程应用、技术迭代和产业化,进而不断丰富建筑工业化的多样性。

非常态无序空间钻石体玻璃幕墙定位安装技术

以沈阳文化艺术中心工程为例,介绍在非常态无序空间钻石体玻璃幕墙的定位安装中,数字化测量控制和模拟技术的应用。