基于GPX4通路的益气解毒方抗脑缺血铁死亡保护机制研究

目的研究益气解毒方抗急性缺血性脑卒中铁死亡相关保护机制。方法采用大脑中动脉栓塞(MCAO)法复制大鼠急性脑缺血模型,同时构建PC12细胞糖氧剥夺(OGD)模型。缺血24 h后进行神经行为学评分和脑梗死体积测定。ELISA法检测MCAO大鼠结肠内容物中短链脂肪酸(SCFA)含量,普鲁士蓝染色观察缺血侧脑组织Fe^(2+),JC-1和刃天青分别检测缺血侧脑组织线粒体膜电位和活力,并对缺血侧脑组织中亚铁离子、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平,及血清中三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量进行测定。采用分子对接预测益气解毒方与GPX4蛋白的结合度。Western blot法检测大鼠缺血侧脑组织G蛋白偶联受体41(GPR41)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、p53蛋白表达水平,流式细胞术和Western blot法检测细胞GPX4蛋白表达水平。结果在动物实验中,与模型组相比,益气解毒方中、高剂量组大鼠神经行为评分与脑梗死体积显著降低(P<0.01),结肠内容物中SCFA含量增加(P<0.01),缺血侧脑组织铁离子颗粒物沉积减少,线粒体膜电位升高(P<0.05),线粒体活力显著增加(P<0.01),缺血侧脑组织中GSH、SOD、GPR41、GPX4水平显著升高(P<0.05或P<0.01),Fe^(2+)、MDA、p53水平显著降低(P<0.01),TG、LDL-C显著降低(P<0.05,P<0.01),HDL-C显著增加(P<0.05);在细胞实验中,与OGD组相比,益气解毒方组和Fer-1组能使细胞GPX4蛋白表达增加(P<0.01)。结论益气解毒方抑制铁死亡可能是其发挥急性脑缺血保护作用的又一关键作用机制,其作用可能与GPX4相关通路密切相关。

基于“脾虚为本”成因关联性探析功能性消化不良致病机制

功能性消化不良(FD)是消化系统常见疾病,其病势绵长、难以根治,对患者日常生活产生严重影响。FD胃肠动力障碍、肠道菌群失调、线粒体功能紊乱等发病机制与中医学脾虚后脾胃升降失司、肠道传送失职等观点相契合。本文从“脾虚”与FD的致病机制关联性入手,将“脾主肌肉”“脾主运化”“脾为后天之本”与FD关键病机相结合进行论述,深入探讨脾脏在FD发生发展及治疗过程中的重要性,为中医药治疗FD提供理论依据。

小儿感冒宁颗粒对脾虚型功能性消化不良大鼠胃肠运动及血清胃肠激素水平的影响

目的:考察小儿感冒宁颗粒对脾虚型功能性消化不良(FD)大鼠模型的药效作用。方法:特制饲料喂养制备SD大鼠脾虚型FD模型。造模前大鼠随机分为6组,即对照组,模型组,儿宝颗粒组(EB,7.10 g·kg^(-1)·d^(-1)),小儿感冒宁低、中、高剂量组(3.55、7.10、14.20 g·kg^(-1)·d^(-1)),每组10只。除对照组外,其余各组大鼠每日给予特制饲料喂养进行造模。持续造模1周后开始给药,连续20 d。每周2次测定各组大鼠一般状态评分、体质量、24 h进食量、24 h饮水量;给药结束后测定各组大鼠胃排空率、胃重指数、小肠推进率、胸腺指数、脾脏指数;苏木素-伊红(HE)染色法观察大鼠十二指肠、结肠、胃窦部位的组织病理学改变;Image J软件测量小肠绒毛高度、宽度、绒毛间隙、结肠固有层厚度、腺体横截面积、胃窦黏膜浅层破损厚度;酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清胃泌素(GAS)、胃动素(MTL)、胆囊收缩素(CCK)、血管活性肠肽(VIP)及瘦素(LEP)含量。结果:与模型组比较,小儿感冒宁颗粒可降低脾虚型FD模型大鼠一般状态评分,缓解体质量增长缓慢及饮水减少,显著增加胃排空率、小肠推进率(P<0.05,P<0.01),改善十二指肠、结肠及胃窦组织病理学特征异常。此外,小儿感冒宁颗粒能够显著升高模型大鼠血清GAS、MTL水平(P<0.05,P<0.01),显著降低血清CCK、VIP、LEP水平(P<0.05,P<0.01)。结论:小儿感冒宁颗粒可通过促进胃排空和小肠推进、调节血清胃肠激素水平起到改善脾虚型FD的作用。

二氢丹参酮Ⅰ灌胃对急性缺血性脑卒中大鼠神经功能改善作用及其机制

目的探讨二氢丹参酮Ⅰ(DT)灌胃对急性缺血性脑卒中大鼠神经功能的改善作用及其机制。方法将50只SD大鼠随机分为假手术组、模型组以及DT低、中、高剂量组。采用线栓法制备大鼠MCAO模型,假手术组仅分离血管,不进行插栓处理。造模后24 h,DT低、中、高剂量组分别给予1.67、5、15 mg/kg DT溶液灌胃,假手术组和模型组给予等量含2%DMSO的生理盐水灌胃,每天1次,连续7 d。造模24 h后和给药7 d后,采用Zea-Longa五分制评分法对大鼠进行神经行为学评分;采用TTC染色测算脑梗死体积;造模后和给药7 d后使用激光散斑血流仪检测大鼠缺血侧局部脑血流灌注量;HE染色观察缺血侧脑组织海马区的病理形态;Western blotting法检测缺血侧脑组织血管新生相关蛋白血管内皮生成因子(VEGF)、CD31、缺氧诱导因子1α(HIF-1α)表达。结果模型组大鼠神经行为学评分及脑梗死体积大于假手术组(P均<0.01),缺血侧脑血流灌注量变化率低于假手术组(P<0.01);与模型组比较,DT中、高剂量给药组神经行为学评分降低,脑梗死体积减小,缺血侧脑血流灌注量增加(P均<0.05),其中高剂量组神经行为学评分、脑梗死体积低于低剂量组,脑血流灌注量高于低剂量组(P均<0.05)。与假手术组比较,模型组大鼠缺血侧海马区细胞排列紊乱,细胞肿胀破裂,细胞核固缩,给药7 d后,DT各剂量组大鼠海马区细胞状态均有不同程度的改善,其中高剂量组改善最为明显。与假手术组比较,大鼠缺血侧脑组织中VEGF、HIF-1α表达增加、CD31表达下降(P均<0.01),与模型组比较,DT中、高剂量组VEGF、CD31、HIF1α表达显著增加(P均<0.01),DT高剂量组显著高于低剂量组(P均<0.01)。结论DT可改善急性缺血性脑卒中大鼠的神经功能,缩小脑梗死体积,改善局部脑血流灌注,具有促进缺血后血管生成和神经保护作用,其机制可能与促进HIF-1α表达有关。

基于微生物-脑-肠轴探讨益气解毒方抗缺血性脑卒中作用机制

目的:从微生物-脑-肠轴(MGBA)角度探讨益气解毒方(YQ)治疗缺血性脑卒中(IS)的可能作用机制。方法:将大鼠随机分为5组,每组6只,分别为假手术组、模型组、YQ低、中、高剂量组(1、5、25 mg˙kg^(-1)),除假手术组外,其余各组采用线栓法建立大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型。首先采用神经行为学评分判断是否建模成功并对YQ的缺血性脑卒中保护作用进行评价,再通过16S rDNA测序技术比较大鼠MCAO造模前后及YQ给药后肠道菌群的变化,并分析该方作用可能相关的生物学通路。最后通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清中炎症因子白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-17A(IL-17A)和白细胞介素-10(IL-10)的表达,通过蛋白免疫印迹法(Western blot)检测紧密连接蛋白ZO-1和Occludin在脑和肠组织中的表达,苏木素-伊红(HE)染色观察脑皮层区和结肠的病理变化,对可能的作用机制进行验证。结果:YQ显著提高了MCAO大鼠的神经行为学评分(P<0.01),对在急性期由于富集病原体和机会致病菌引发的肠道微生物紊乱起到了较好调节作用,其中显著变化的微生物包括摩根氏菌属、埃希氏-志贺氏菌属、Adlercreutzia和安德克氏菌属等,并通过生物信息学分析发现这些菌可能与脑内炎症调节密切相关。与假手术组比较,血清中炎症因子检测发现IS模型大鼠血清中炎症因子IL-6与IL-17A显著升高(P<0.01),抑炎因子IL-10的含量显著降低(P<0.01);与模型组比较,给药组血清中炎症因子IL-6与IL-17A的含量明显降低(P<0.05),抑炎因子IL-10的含量显著增加(P<0.01)。屏障蛋白ZO-1和Occludin的表达结果表明IS模型大鼠在脑、结肠组织中两者的表达量均明显降低(P<0.05),给药组两者的表达量均明显增加(P<0.05)。结论:急性脑缺血可导致肠道微生物群失调,破坏肠道屏障,增加肠道通透性。YQ可调节脑缺血引起的肠道菌群失调、抑制全身炎症反应和改善肠道-血脑屏障的破坏,阻止脑组织因炎症导致的继发性级联损伤。微生物-脑-肠轴可能是其发挥抗缺血性脑卒中作用的重要机制。

基于线粒体MCU通道探究甲基莲心碱促血管再生抗脑缺血的作用机制

目的:探究甲基莲心碱(Nef)通过调控线粒体钙单向转运体(MCU)离子通道促进血管再生,进而抗脑缺血的作用机制。方法:以微血管缺失斑马鱼肠下血管面积为指标,对Nef进行血管再生功效评价,并计算半数有效浓度(EC50)。将大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性药组(丁苯酞,6 mg·kg^(-1))、Nef低、中、高剂量组(0.125、0.625、3.125μg·kg^(-1)),除假手术组外,其余各组建立大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,造模完成后各组按相应剂量灌胃给药,假手术组、模型组灌胃给予等体积生理盐水,1次/d,连续7 d。对各组大鼠进行神经行为学评分,并通过2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色计算缺血侧脑组织梗死率;散斑血流成像系统测定各组大鼠局部脑血流量(rCBF);免疫荧光及蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组大鼠血管内皮生长因子(VEGF)、血小板内皮细胞黏附分子-1(CD31)、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)蛋白表达。将人脐静脉内皮细胞(HUVECs)分为正常组、模型组、阳性药(黄芪甲苷,10μmol·L^(-1))组、Nef组(32 nmol·L^(-1));在验证Nef线粒体保护作用及促血管再生机制时,增设精胺组(MCU激动剂)、Nef+精胺组,除正常组外,其余各组建立糖氧剥夺(OGD)的HUVECs模型,通过噻唑蓝(MTT)法检测细胞活力,划痕实验与管成实验评估细胞迁移能力,应用Rhod-2 AM、Fluo-3 AM、JC-1、Calcein AM荧光探针,以及细胞能量代谢分析仪分析Nef的线粒体保护作用。通过分子对接预测Nef与MCU、HIF-1α的结合能力,采用Western blot检测Nef对OGD模型HUVECs中MCU、B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白(Bax)、胱天蛋白酶-3(Caspase-3)和HIF-1α蛋白表达的影响。结果:对微血管缺失斑马鱼的血管生成结果显示,与正常组比较,模型组的肠下血管面积显著下降(P<0.01);与模型组比较,不同浓度Nef组肠下血管面积显著提高(P<0.01),最大耐受浓度为10.24μmol·L^(-1),EC50为0.23μmol·L^(-1)。对MCAO大鼠的抗脑缺血结果显示,与假手术组比较,模型组rCBF显著下降,脑梗死率显著增加,CD31表达显著下降(P<0.01),VEGF、HIF-1α蛋白表达明显上升(P<0.05);与模型组比较,各给药组rCBF显著提高,梗死体积显著减少,CD31、VEGF、HIF-1α蛋白表达量显著增加(P<0.01)。细胞实验结果显示,与正常组比较,模型组细胞存活率降低,迁移能力下降,细胞质内Ca^(2+)和线粒体内Ca^(2+)水平上升,线粒体膜通透性转换孔(MPTP)开放程度降低,线粒体能量代谢能力下降,MCU、Bax、Caspase-3、HIF-1α的蛋白表达增加(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,Nef组细胞存活率上升,迁移能力提高,细胞质内Ca^(2+)和线粒体内Ca^(2+)水平下降,MPTP开放上升,细胞线粒体能量代谢能力升高,MCU、Bax、Caspase-3的蛋白表达下降,HIF-1α蛋白表达增加(P<0.05,P<0.01)。结论:Nef能够稳定线粒体膜电位,抑制线粒体凋亡;并通过下调MCU的表达,抑制细胞内Bax、Caspase-3的激活,同时激活HIF-1α信号通路,增强VEGF、CD31的表达,进而促进血管再生来治疗缺血性脑损伤。