人β防御素3和γ干扰素在MAPK信号通路中的相互诱导及联合抗甲型流感病毒的机制

目的 探讨人β防御素3(HBD3)和γ干扰素(IFN-γ)在丝裂源活化蛋白激酶(MAPK)信号通路中相互诱导作用及体外联合抗甲型流感病毒(IAV)H1N1的作用。方法 不同剂量IFN-γ(12.5、25.0、50.0、100.0μg/L)或HBD3(0.25、0.50、1.00、2.00 mg/L)分别作用人支气管上皮细胞BEAS-2B 4、12、24、48 h,另设立p38 MAPK、ERK和JNK通路抑制剂预处理后、用IFN-γ(25.0μg/L)或HBD3(1.00 mg/L)处理BEAS-2B细胞4 h, qRT-PCR和ELISA检测HBD3及IFN-γ基因和蛋白表达,Western blot检测p-p38 MAPK、p-ERK、p-JNK蛋白表达;25.0μg/L IFN-γ、1.00 mg/L HBD3、HBD3 siRNA转染及IFN-γ中和抗体(0.50 mg/L)单独或联合作用BEAS-2B细胞、用5×TCID50H1N1感染,qRT-PCR和Western blot检测IAV核蛋白(NP)基因和蛋白的表达情况。结果 在BEAS-2B细胞中,不同剂量的IFN-γ与HBD3可互相诱导表达(P<0.05或P<0.01),且均可诱导p-p38 MAPK、p-ERK和p-JNK的表达上调(P<0.01);p38 MAPK、ERK和JNK通路抑制剂预处理,均明显下调IFN-γ诱导的HBD3表达、及HBD3诱导的IFN-γ表达(P<0.01);IFN-γ和HBD3单独或联合使用均可明显抑制BEAS-2B细胞中H1N1 NP的表达(P<0.05或P<0.01),转染HBD3 siRNA减弱了IFN-γ抑制H1N1 NP表达的作用(P<0.01),IFN-γ中和抗体介入对HBD3抑制H1N1 NP表达的作用无显著影响(P>0.05)。结论 在BEAS-2B细胞中,HBD3和IFN-γ可通过MAPK通路相互诱导表达,且2者联合使用可增强抗IAV H1N1的作用。

肝素酶在人β-防御素-3抗甲型流感病毒的作用研究

目的探讨肝素酶在人β-防御素-3(Humanβ-defensin 3,HBD3)抗甲型流感病毒(Influenza A virus,IAV)中的作用。方法采用CCK8法检测肝素酶对人支气管上皮细胞(BEAS-2B)的毒性情况;经肝素酶处理BEAS-2B细胞,并在4℃下与HBD3和IAV病毒液孵育2 h,分为未处理组(HBD3+IAV),肝素酶+HBD3+IAV组,提取细胞总RNA和总蛋白,采用qRT-PCR检测感染细胞中的NP mRNA表达水平,Western blot和免疫共沉淀检测HBD3和IAV HA蛋白表达水平以及HBD3和HA蛋白的相互作用。试验设未经肝素酶处理BEAS-2B细胞对照组。结果肝素酶作用48 h,其浓度在30 U/mL以下浓度时对细胞无毒性作用;HBD3干预IAV感染细胞后细胞中的NP mRNA表达水平显著降低(t=12.81、26.13、28.68,P<0.01),经肝素酶处理IAV感染的细胞其NP mRNA表达水平升高(t=-4.55,P<0.05),结果显示HBD3可抑制病毒复制,而经肝素酶处理IAV感染的细胞其病毒未减少,表明只使用肝素酶不能降低病毒感染;与未经肝素酶处理的细胞相比,经肝素酶处理的细胞中HBD3和HA蛋白表达水平降低,以及HBD3和HA蛋白的相互作用显著降低(P<0.01),表明HBD3和肝素酶共同作用可降低HA的表达来阻止IAV进入细胞。结论肝素酶和HBD3共同作用可以抑制病毒进入细胞,具有抗甲型流感病作用。