基于基因组重测序的广西地方猪种遗传多样性和选择信号分析

【目的】基于全基因组重测序研究分析广西地方猪种与西方商业猪种的遗传结构,挖掘出广西地方猪种的选择基因,为我国地方猪种质资源的保存和利用打下基础。【方法】对广西地方猪种(巴马香猪、东山猪和陆川猪)和西方商业猪种(杜洛克猪、长白猪和大白猪)共60头猪个体进行基因组重测序分析,经质控后分别进行猪种亲缘关系、主成分层次、连锁不平衡衰减、群体遗传结构、系统发育进化树及群体遗传分化指数(Fst)等分析。【结果】西方商业猪种与广西地方猪种间的群体遗传关系较远,西方商业猪种群体聚集在一起,而广西地方猪种群体较分散;构建的系统发育进化树显示,6个猪种聚类成3个分支,其中,东山猪单独聚为一支,巴马香猪和陆川猪聚为一支,而杜洛克猪、大白猪和长白猪聚类在另一分支上。广西地方猪种组均被选择的位点共有641个受选择区域,最终定位注释到108个基因,其中Cenpp基因的受选择区域高达25个。这些基因显著注释到自然杀伤细胞分化正向调控、翻译抑制因子活性、mRNA调控元件结合、肽激素加工、正调控细胞迁移参与新生血管生成、电压门控离子通道活性及离子跨膜转运调控等GO功能条目;KEGG信号通路富集分析发现显著富集于内吞作用、cGMP-PKG信号、胆汁分泌、肌醇磷酸盐代谢和磷脂酰肌醇信号系统等通路上。【结论】广西地方猪种与西方商业猪种间存在明显差异,但广西地方猪种内部存在较高的近交现象,部分猪种可能受到西方商业猪种的影响,而导致其血统不纯。广西地方猪种共有641个受选择信号区域,定位注释到的108个基因主要参与离子跨膜转运、磷脂酰肌醇信号系统、正调控细胞迁移及新生血管生成等通路,其中Mrps27基因可能与广西地方猪种独特的生长发育有关。

家兔超数排卵的研究

为了寻求家兔合理的超排方案,构建获得家兔卵子和胚胎的实验平台,进行3个试验:Ⅰ比较不同剂量(40、50、60、70、80和90 IU)的孕马血清促性腺激素(PM SG)对家兔超排效果的影响;Ⅱ比较不同的促卵泡素(FSH)处理方法(恒量法和递减法)对超排效果的影响;Ⅲ比较手术后重复超排对家兔超排效果的影响。结果显示:(1)经过80 IU的PM SG超排处理后,日本长耳白兔卵巢平均排卵点数和平均回收卵子数都显著高于40、50、60、70和90 IU组(P<0.05);(2)用FSH递减法、恒量法和80 IU PM SG超排处理时,日本长耳白兔卵巢平均排卵点数和平均回收卵子数的差异不显著(P>0.05);(3)进行一次手术后重复超排,手术后重复超排的新西兰兔与术前超排效果相比,卵巢平均排卵点数和平均回收卵子数的差异不显著(P>0.05);(4)激素处理不同品种的家兔,左右两侧卵巢排卵点数和平均回收卵子数的差异均不显著(P>0.05)。结论:(1)应用PM SG进行母兔超排处理时,80 IU剂量的超排效果比较好;(2)应用FSH时,采用递减法和恒量法得到的结果差异不显著,在实践中两种方法均可用;(3)适宜的PM SG剂量(80 IU)对兔子的超排效果与FSH相似,在兔子超排处理时,可用PM SG代替FSH;(4)两次手术过程并不会影响超排效果。

猪单个卵母细胞体外转录体系的建立

利用switching mechanism at 5′end of RNA transcript(SMART)技术对猪单个体外成熟培养的MⅡ期卵母细胞进行了扩增,在此基础上,利用T7体外转录技术进行体外转录,aRNA浓度达到1.962μg。通过联合SMART技术和T7体外转录技术,mRNA浓度扩增了2.3×104倍左右,这个数量级已基本能满足cDNA array等通量筛选研究的需求。本研究为珍贵和微量的生物材料进行高通量筛选研究提供了一个有效的体系。

数字差异显示法在猪早期胚胎基因表达分析上的应用

借助于NIH生物信息中心Unigene里的数字差异显示软件平台,分析了猪植入前后早期胚胎发育9个EST文库的105 227个ESTs,筛选出了104个差异表达ESTs,对已知功能的差异表达基因进行GO分类分析,发现这些差异基因参与了广泛的生物功能和过程。同时,这些差异表达ESTs的聚类分析结果显示,体外和体内发育的囊胚基因表达存在较大的差异。对这些差异表达ESTs表达模式的分析结果显示,猪植入前早期胚胎发育阶段基因呈振荡模式表达,其中线粒体和核糖体相关基因的表达在囊胚中的表达丰度要明显高于其他阶段。表达数字差异显示的结果能为猪早期胚胎发育机理的研究提供线索。

猪胎儿肾脏成纤维细胞体外培养体系的建立

本研究旨在建立猪胎儿肾脏成纤维细胞体外培养体系,并探讨其作为猪体细胞克隆供体的可能性。使用组织块培养法从体长为10cm以上的猪胎儿分离得到猪胎儿肾脏成纤维细胞,绘制了生长曲线,鉴定了细胞类型并且进行了细胞周期同期化效果的研究。结果表明:该培养体系可以支持猪胎儿肾脏成纤维细胞的体外生长,单个细胞均为梭形细胞,抗波形蛋白免疫荧光染色显示为阳性,而抗角形蛋白免疫荧光染色为阴性,分离到的细胞为胎儿肾脏成纤维细胞。使用血清饥饿法和接触抑制法诱导细胞进入G0/G1期,并且分别比较两者同期化效率,结果显示:血清饥饿2d和4d的同期化效率差异不显著,但都比8d组的高(88.97%和87.69%比82.45%,P<0.05);接触抑制4d、6d组间同期化效率差异不显著,但都比0d组的高(85.56%和85.89%比81.82%,P<0.05)。本研究在国内首次分离得到猪胎儿肾脏成纤维细胞,已经在体外传代培养到32代,其同期化效果好,可以作为体细胞克隆供体。

使用流式细胞仪分离精子进行仔猪性别控制的研究

本研究旨在探索流式细胞仪分离精子在猪性别控制中的应用。使用流式细胞仪分离猪XY精子,而后通过母猪输卵管授精生产"预知"性别的仔猪,并使用吖啶橙染色法检测粗分离对精子核酸含量的影响。结果,成功利用分离获得的猪X和Y精子对母猪进行输卵管授精,母猪怀孕率、产仔率均为100%;输Y精子母猪产仔雄性率100%(♂6/6),对照母猪产仔雄性率57.14%(♂8/14);3头输X精子母猪产母仔率91.67%(♀11/12),对照母猪产雌性仔猪40%(♀2/5);使用性别分离精子不影响母猪的怀孕率、产仔率,但窝产仔数较低;吖啶橙染色法检测结果表明,流式细胞仪粗分离对猪精子核酸含量没有显著影响(P>0.05)。本研究结果提示,使用流式细胞仪分离精子授精可以有效改变仔猪的性别比例。本研究结果为猪分离精子性别控制技术的推广应用奠定了基础。

猪卵母细胞化学辅助手工去核及手工核移植胚胎发育能力因素的研究

本研究在筛选猪化学辅助手工去核最佳脱羰秋水酰碱(Demecolcine,DC)浓度的基础上,探讨了各种因素对手工重构胚发育的影响,以期建立高效的猪手工体细胞核移植技术体系。观察不同成熟时间卵母细胞在不同DC浓度下的去核效率,并进一步比较了化学辅助手工去核法和荧光染色去核法、不同类型的供体细胞(颗粒细胞、新生巴马肌肉成纤维细胞和胎儿成纤维细胞)和供体细胞的不同处理方法(70%～80%汇合、血清饥饿法和100%接触抑制法)对重构胚发育能力的影响。结果表明:(1)利用DC诱导去核,对体外成熟培养44h的卵母细胞以浓度0.4μg.mL-1作用0.5～1h为宜。(2)用DC化学辅助手工去核与用荧光染色去核的重构胚囊胚发育率差异不显著(13.11%vs 9.25%,P>0.05)。(3)以胎儿成纤维细胞、颗粒细胞和新生巴马小型猪肌肉成纤维细胞为供体构建的重构胚的融合率、卵裂率及囊胚率均差异不显著(P>0.05)。(4)用70%～80%汇合(对照组)组、接触抑制组和血清饥饿组的细胞作供体构建的重构胚,在融合率上,接触抑制组显著高于对照组(P<0.05);在分裂率与囊胚率上,各组之间均无显著差异(P>0.05)。研究结果表明,化学辅助手工去核法在实际生产中可以替代荧光染色去核法,能省去去核过程中荧光染色及紫外光照射去核等步骤,从而简化了猪手工体细胞核移植程序,提高了猪手工体细胞核移植效率,能为高效的猪手工体细胞核移植技术体系的建立提供参考。

猪手工体细胞核移植电融合/激活参数的优化

通过对猪体细胞核移植中电融合及联合化学激活对猪重构胚发育能力进行探讨,为广西巴马小型猪的手工克隆搭建平台。利用手工克隆(HMC)技术对猪体细胞核移植胚胎采用不同的电融合方法和融合后化学激活不同时间,研究猪手工克隆胚胎的发育能力。结果表明:(1)对重构胚进行一步法电融合时,参数2(180V·mm-1,30μs×1次)与参数1(160·mm-1,30μs×1次)两组间的融合率差异显著(65.31%vs58.33%,P<0.05);(2)对重构胚进行两步法融合时,参数3(第一次:180V·mm-1,10μs×1次,融合60min后进行第二次融合;第二次:85V·mm-1,80μs×1次)和参数4(第一次:200V·mm-1,10μs×1次,融合60min后进行第二次融合;第二次:85V·mm-1,80μs×1次)两组间的总融合率差异不显著(75.88%vs81.20%,P>0.05);(3)采用参数4与采用参数2融合的重构胚其分裂率和囊胚率均差异不显著((79.98%vs72.66%)和(13.14%vs9.36%),P>0.05);(4)在电激活和CHX+CB联合激活4、5、6h这3组中,其分裂率和囊胚率均差异不显著(P>0.05)。相对而言,重构胚采用参数4的两步融合法和CHX+CB激活5h效果较好。

不同生理状态及激素量对小鼠超数排卵及后续胚胎发育的影响研究

探讨不同生理状态及激素量对小鼠超数排卵后取胚效果及后续胚胎发育的影响。结果发现,不同生理状态:①超排效果,发情间期(29.52枚/只)与发情期(29.12枚/只)超排结果差异不显著(P>0.05);②胚胎发育,发情间期组所得分裂率和囊胚率(81.99%,58.54%)略高于发情期(81.18%,57.83%),但差异不显著(P>0.05)。不同激素量:①超排效果,5 IU PMSG+5 IU HCG注射组略高于10 IU PMSG+10 IU HCG,但差异不显著(P>0.05);②胚胎发育效果,两种激素注射方式差异不显著(P>0.05),2试验组分裂率所得效果相近;5 IU PMSG+5 IU HCG注射组(68.08%)囊胚率高于10 IU PMSG+10 IU HCG注射组(53.33%)。结论:在发情间期,采用5 IU PMSG+5 IU HCG的激素量进行超排,所得超排及后续胚胎发育效果较好。

瘦素对水牛卵母细胞体外成熟和体外受精胚胎发育的影响

【目的】探讨瘦素在水牛体外胚胎生产体系中的作用机理,提高体外胚胎生产效率,为利用分离精子加速水牛品种改良及良种群的扩繁奠定基础。【方法】分别在水牛卵母细胞成熟培养液和胚胎培养液中添加瘦素,研究其对水牛卵母细胞体外成熟率和体外受精胚胎发育率的影响。【结果】在水牛卵母细胞体外成熟液阶段,添加瘦素不仅能促成熟,还能提高其胚胎发育潜能;在体外受精后的胚胎培养阶段,添加瘦素也能显著提高囊胚发育率,二者的最佳瘦素浓度均为10ng/mL。在最佳瘦素浓度(10ng/mL)下,常规精子体外受精后的囊胚发育率从19.7%(空白对照组)提高到27.0%,分离精子体外受精后的囊胚发育率从12.3%(空白对照组)提高到17.4%。【结论】瘦素能促进水牛卵母细胞体外成熟及体外受精胚胎发育,并以添加10ng/mL瘦素的促进效果最明显。

精原干细胞更新分化的影响因素

精原干细胞可以体外培养、冷冻保存、遗传操作及移植,因而在医学、生物学及动物科学方面均有广泛应用前景。根据现有资料阐述一些因素,包括c Kit受体及其配体SCF、白血病抑制因子(LIF)、维生素A(VA)、表皮生长因子(EGF)、胶质细胞源神经营养因子(GDNF)、激素和温度,对精原干细胞更新分化的影响。

基于AMEL基因位点差异的水牛性别PCR鉴别方法

【目的】建立检测不同性别水牛染色体AMEL基因位点差异的PCR鉴别方法,为水牛早期胚胎性别鉴定及水牛分离精子重分析提供简便可靠的检验手段。【方法】采用PCR扩增不同性别水牛染色体中的AMEL基因,Clone Manager 9.0软件分析序列差异,BLASTn程序分析基因同源性,MEGA 6.06软件构建系统发育进化树。【结果】以水牛血液基因组DNA为模板、amel B1为引物,引物退火温度60℃,公水牛可扩增出两条清晰条带,长度分别为376（AMEL-X基因）和304 bp（AMEL-Y基因）;母水牛仅扩增出1条清晰条带,长度为376 bp（AMEL-X基因）。与AMEL-X基因相比,水牛AMEL-Y基因缺失155-226区域的72 bp,同时存在20个基因型多态位点。临床检测结果证实,基于AMEL基因的PCR鉴别结果与实际性别的吻合率达100%,amel B1引物的灵敏度为0.5 ng模板量。BLASTn比对分析结果显示,水牛AMEL-X和AMEL-Y基因与不同哺乳动物的对应序列存在高度保守性,其相似性均接近或高于90%,与牛存在最近的亲缘关系。【结论】AMEL基因在哺乳动物中高度保守,且在不同性别水牛中呈多态性特征,以其作为分子靶标建立的水牛性别PCR鉴定方法切实可行,为水牛早期胚胎性别鉴定及水牛分离精子重分析提供了一个更便捷、高效的检验手段。

猪早期孤雌胚组蛋白乙酰化与组蛋白去乙酰化酶基因mRNA表达水平相关性研究

【目的】探讨猪孤雌胚早期发育过程中组蛋白H4K5乙酰化水平与组蛋白去乙酰化酶(HDAC1)基因mRNA表达水平之间的关系。【方法】收集早期猪孤雌胚(2-细胞、4-细胞、桑椹胚和囊胚),运用细胞免疫组化和激光共聚焦显微镜,通过检测这些胚胎的相对荧光强度来评判其H4K5的乙酰化水平;运用实时定量PCR的方法检测猪早期孤雌胚发育过程中HDAC1基因mRNA表达的动态变化。【结果】从2-细胞到囊胚开始,其H4K5的乙酰化均在细胞核内表达,且各阶段表达量逐步提高,至囊胚期达最高(分别为1124.77±127.78、1305.81±184.23、1795.19±318.67及2149.63±529.47),差异显著(P<0.05);从2-细胞到囊胚,其HDAC1基因mRNA表达逐步降低(分别为1.00±0、0.91±0.009、0.85±0.008及0.67±0.006),各阶段差异显著(P<0.05)。【结论】从2-细胞到囊胚,其H4K5的乙酰化水平与HDAC1基因mRNA表达水平之间呈负相关。

不同月份猪卵母细胞体外成熟效果比较

【目的】分析卵母细胞发育与不同季节（月份）的相关性，为提高猪卵母细胞的体外成熟效率奠定基础。【方法】2012年2～6月从南宁市某屠宰场收集猪卵巢采集卵母细胞，经体外成熟（IVM）40-44h，然后随机挑出成熟后的卯母细胞进行地衣红染色，相差显微镜下观察、记录卵母细胞发育成熟的各个时期，并分析卵母细胞发育时期与不同月份温度、湿度的相关性。【结果】随着月份的增加，GV期和GVBD期卵母细胞所占比例整体上呈下降趋势，AT期所占比例呈上升趋势，除5月外，MII期所占比例整体上也呈上升趋势，6月MII期所占比例最高，为42．31％。2、3、4月的GVBD期所占比例显著高于6月所占比例（4．40％）（P〈0．05）。从卵母细胞发育时期与不同月份温度、湿度的相关性分析结果可知，GV期、GVBD期、MI期3个时期与温度变化呈负相关，与湿度变化呈正相关；而AT期、MII期与温度变化呈正相关，与湿度变化呈负相关。【结论】不同月份猪卵母细胞的ⅣM效果存在一定差异。在高湿低温月份，GV期和GVBD期的卵母细胞所占比例较大，MII期所占比例较小；而在低湿高温月份，Gv期和GVBD所占比例较小，MII期所占比例较大。

猪精子和睾丸组织RNA的初步分析

试验采用Trizol一次法提取猪精子和睾丸组织的总RNA,然后通过RT-PCR扩增的方法,检测精子和睾丸组织中Protamine-1(PRM-1)、Protamine-2(PRM-2)、Clusterin、Heat shock protein 90(HSP90)、C-myc基因的mR-NA是否存在;通过不同精子数量的使用,检测在本试验条件下扩增出清晰PRM-1带所需要的适宜精子数量;通过琼脂糖电泳检测精子与睾丸组织RNA的电泳特征。结果,猪睾丸组织中有PRM-1、PRM-2、Clusterin、HSP90、C-myc的mRNA,而射出的猪精子(上游处理)本试验只检测出PRM-1的mRNA;在使用RNA沉淀剂时,3.0×107～6.5×107精子可得到清晰的PRM-1条带;本试验首次得到猪精子总RNA的普通琼脂糖胶电泳图。初步研究的结果表明:射出猪精子中存在的RNA种类与睾丸组织中存在的RNA种类差异大;猪精子RNA的18S和28S片段与睾丸组织无明显差异。猪精子的RNA需要更多的研究。

水牛卵母细胞玻璃化冷冻后孤雌激活方法的优化

【目的】了解玻璃化冷冻—解冻及不同孤雌激活条件对水牛卵母细胞发育潜能的影响,为构建完善的水牛卵母细胞孤雌激活培养体系奠定基础。【方法】利用玻璃化冷冻法对水牛体外成熟卵母细胞进行冷冻保存1-2 d,解冻复苏后进行孤雌激活,以新鲜的体外成熟卵母细胞为对照,探讨离子霉素浓度、6-二甲氨基嘌呤（6-DMAP）浓度和处理时间对玻璃化冷冻复苏后水牛卵母细胞孤雌激活效果的影响。【结果】与新鲜的体外成熟卵母细胞相比,玻璃化冷冻—解冻复苏后水牛体外成熟卵母细胞孤雌激活的卵裂率、4-细胞率、8-细胞率和囊胚发育率均极显著降低（P〈0.01）。水牛体外成熟卵母细胞经玻璃化冷冻—解冻复苏后,以3.5μmol/L离子霉素激活5 min联合2 mmol/L 6-DMAP培养2 h的孤雌激活效果最佳,其卵裂率、4-细胞率、8-细胞率和囊胚发育率分别为60.6%、45.1%、33.7%和14.8%。【结论】水牛体外成熟卵母细胞经玻璃化冷冻—解冻复苏后,其激活阈值发生改变,因此不宜采用与新鲜体外成熟卵母细胞一致的激活程序进行孤雌激活。

BRL饲细胞及血清浓度对体外小鼠精原干细胞的影响

分别以大鼠肝细胞(BRL)或小鼠胚胎成纤维细胞(STO)为饲养层,采用含5%、10%及20%胎牛血清的培养液,培养6日龄小鼠生精上皮细胞,研究饲养层和血清浓度对精原干细胞生物学行为的影响。结果表明:在培养的第1周内,2个及4个连成串的精原细胞合胞体数量明显增加,同时大多数精原细胞逐渐退化。培养1周后,大多数精原细胞经短暂的存活及分裂活动后退化消失,培养体系中仅保留下少量单个及由细胞间桥相连的双个及4个成串或成团的A型精原细胞。这些细胞在随后的培养过程中,不表现明显的分裂活动,呈圆球形,表达碱性磷酸酶。不同条件培养体系中的精原细胞及精原干细胞的生物学行为无明显不同,培养20～30d时均有少量精原干细胞存活。这说明BRL细胞能用作饲养层促进精原干细胞存活,但对其更新性增殖没有明显作用;培养液中高浓度胎牛血清对精原干细胞存活和增殖无明显影响,但能促进睾丸体细胞增殖。

水牛免疫乳抑菌试验

用奶水牛免役乳抗体提取物进行抑菌试验 ,免疫乳中的抗体表现出较强的抑菌效力。当提取物中的Ig以终浓度为 1.0 mg/ m L 加入到霍乱弧菌和伤寒杆菌的培养液中时 ,能有效地抑制霍乱弧菌和伤寒杆菌的生长。

水牛、奶牛免疫抗体规律的研究

用人用疫苗强化免疫奶水牛或奶牛来生产免疫乳 ,乳汁中甲肝抗体的相对活性效价峰值维持了 1周 ,相对活性效价值在 1.7左右 ,甲抗的相对活性效价在完成全程免疫后除峰值期外 ,都基本维持在一个较低的水平 ,相对活性效价大都在 1.2～ 1.5之间变动。霍乱孤菌抗体、伤寒杆菌抗体、痢疾杆菌抗体在乳汁中出现的时间要比甲抗出现的时间迟 ,且维持的时间很短 ,霍乱孤菌抗体和伤寒杆菌抗体在乳汗中能维持 5周左右 ,痢疾杆菌抗体在乳汁中只维持一个星期。

创新驱动 整合发展——广西奶水牛产业技术体系创新团队建设历程回顾

为增强农业科技自主创新能力，保障我区粮食安全、农产品质量安全和农业可持续发展，广西于2010年3月启动了国家现代农业产业技术体系广西创新团队建设项目。水稻、甘蔗、桑蚕、奶水牛等四个产业被首批纳入该项目进行产业技术体系创新团队建设。广西奶水牛产业技术体系创新团队建设项目启动四年多来，在农业厅、财政厅和区水产畜牧兽医局及上级有关部门的正确领导下，经团队全体成员的积极努力，分工协作，整合资源，围绕产业发展需求，