利用CRISPR/Cas9靶向敲除Piezo1基因对小鼠间充质干细胞成骨分化的影响研究

目的·应用CRISPR/Cas9系统对小鼠间充质干细胞C3H10T1/2进行靶向Piezo1基因稳定敲除,探究Piezo1对间充质干细胞成骨分化能力的影响。方法·根据CRISPR/Cas9原理,设计2条靶向Piezo1基因的单链指导RNA(single guide RNA,sgRNA),利用Lenti-Cas9-GFP和Lenti-U6-sgRNA-mCherry载体分别构建表达Cas9的慢病毒和表达sgRNA的慢病毒。将2种慢病毒感染C3H10T1/2细胞,利用流式细胞分选技术对GFP和mCherry阳性的细胞进行筛选;挑取单克隆细胞,经PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳验证,最终得到Piezo1基因片段敲除的单克隆细胞系。序列测定、实时荧光定量PCR(quantitative realtime PCR,qPCR)及细胞免疫荧光技术对构建的Piezo1基因敲除细胞(Piezol knockout C3H10T1/2,CPK)进行敲除效率验证。CCK-8实验检测敲除Piezo1对细胞增殖的影响;对构建成功的Piezo1基因敲除细胞进行体外成骨诱导分化,并进行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色及茜素红染色,利用qPCR探究敲除Piezo1对细胞的成骨相关基因mRNA水平的影响。结果·琼脂糖凝胶电泳结果显示,敲除Piezo1的单克隆细胞菌液通过PCR扩增后产物出现阳性克隆。单克隆细胞的测序结果显示,敲除Piezo1的单克隆细胞的Piezo1基因在第4外显子中提前形成终止密码子TGA,无法正确翻译蛋白;qPCR验证了CPK中Piezo1基因在mRNA水平被抑制;免疫荧光显示CPK中Piezo1基因的敲除效率较高,基本阻碍Piezo1在细胞中的表达。CCK-8实验显示敲除Piezo1后细胞增殖能力下降(P<0.05);ALP染色及茜素红染色结果显示敲除Piezo1后细胞成骨能力降低(P<0.05),且CPK中成骨相关基因如Ⅰ型胶原蛋白A1(α1 typeⅠcollagen,Col1a1)、Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)、成骨细胞特异性转录因子(osterix,Osx)以及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,Alp)的mRNA表达水平降低(均P<0.05)。结论·利用CRISPR/Cs9基因编辑系统成功构建靶向敲除Piezo1基因的C3H10T1/2细胞系。敲除Piezo1能抑制小鼠间充质干细胞C3H10T1/2的成骨分化。

葛根素对大鼠下颌骨骨髓源巨噬细胞破骨细胞向分化的影响

目的:分析不同浓度的葛根素对于下颌骨骨髓源巨噬细胞(Bone marrow-derived macrophages,BMMs)破骨分化的影响。方法:体外分离培养4周龄雌性大鼠下颌骨BMMs。通过CCK-8分析1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L葛根素对BMMs细胞活性的影响。使用RANKL诱导BMMs破骨分化的同时加入不同浓度葛根素,采用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)酶化学染色及q-PCR分析破骨细胞形成及破骨相关基因的改变。采用SPSS16.0软件包对数据进行统计学分析。结果:1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1μmol/L、10μmol/L葛根素组与对照组活细胞数无显著差异,100μmol/L组活细胞数较对照组降低(P<0.05)。RANKL可诱导BMMs形成多核破骨细胞。10 nmol/L、100 nmol/L及1μmol/L葛根素组破骨细胞数目及破骨细胞面积均较对照组降低(P<0.05)。q-PCR分析发现,10 nmol/L、100 nmol/L及1μmol/L葛根素组NFATc1、C-fos、TRAP及CTSK mRNA表达量均较对照组下降(P<0.05)。结论:葛根素可抑制下颌骨BMMs破骨分化及相关基因表达,为葛根素应用于下颌骨骨质疏松症的预防与治疗提供了依据。

流体剪应力在骨髓基质干细胞成骨向分化中作用机制的研究进展

细胞在体内受到流体剪应力、机械应变、流体静压力等机械应力的作用,其中流体剪应力（fluid shear stress,FSS）被认为是维持骨稳态及骨改建过程中最重要的应力。目前研究多集中在FSS对骨细胞及成骨细胞的作用上,骨髓基质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）的研究相对较少。BMSCs对骨改建及治疗具有重要的意义,BMSCs对FSS的应答越来越受到关注。BMSCs对FSS的反应涉及细胞骨架、基质刚度及弹性、成骨信号等方面。总结FSS在BMSCs内的力转导机制、对其分化及功能的改变等方面的研究进展,为今后构建组织工程化骨、骨病变的治疗等研究提供思路。

信号转导与转录活化因子3在骨稳态和机械力介导骨重建中的作用机制

骨稳态是骨的形成与吸收维持相对平衡的过程。信号转导和转录活化因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)参与多条细胞内外的信号转导通路,与骨稳态息息相关。STAT3参与由众多因素调控的成骨细胞分化过程;也可通过调控破骨细胞的募集、分化和活性等维持骨稳态;还影响骨稳态中成骨-破骨细胞的交互通讯。STAT3突变的患者则表现出多种遗传性骨代谢疾病。此外,STAT3在机械应力介导的骨重建中也起重要作用。机械力刺激通过上调或激活STAT3促进成骨分化和骨生成,进而调控骨重建。综述STAT3在维持骨稳态中的作用以及可能的作用机制,并探讨骨重建中机械力刺激与STAT3的联系,为骨疾病的治疗提供潜在药物靶点。

诱导型成骨细胞特异Stat3基因敲除小鼠的构建及验证

目的:运用Cre-Loxp基因敲除系统,构建诱导型条件性Stat3基因敲除小鼠并验证其敲除效率。方法:通过Stat3fl/fl与Col1 creERT2基因型的C57小鼠多代杂交,构建诱导型成骨细胞特异Stat3敲除小鼠Stat3Col1ERT2。取其骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs),加入4-羟基他莫西芬(4-OTH)后,采用实时定量PCR技术和免疫印迹技术在m RNA与蛋白水平分别体外验证Stat3敲除效果。于小鼠腹腔注射他莫昔芬,采用免疫荧光染色技术,观察小鼠上颌牙槽骨区域STAT3的表达,以体内验证敲除效果。采用SPSS 24.0软件包对数据进行统计学分析。结果:实时定量PCR和免疫印迹结果显示,Stat3Col1ERT2小鼠BMSCs体外加药诱导敲除后,STAT3的m RNA水平显著下调(P<0.05)、蛋白表达降低(P<0.05)。免疫荧光染色结果显示,Stat3Col1ERT2小鼠体内上颌牙槽骨区域成骨细胞的STAT3表达显著降低(P<0.05)。结论:本研究成功构建了诱导型成骨细胞特异Stat3基因敲除小鼠,使基因敲除可受观察者时空调控,为今后正畸牙移动、颌骨牵引成骨、颌骨骨折等牙槽骨改建机制的研究提供了新的思路及依据。

微振动在骨髓间充质干细胞成骨向分化中的作用机制研究进展

微振动是指系统相对平衡位置幅度很小的周期性偏离,而高频率、低振幅的微振动(low-magnitude high-frequency vibration, LMHFV)对骨骼系统细胞的作用力与肌肉运动时对骨骼产生的力学刺激相似。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)作为力学敏感细胞,存在于骨髓基质,具有多向分化潜能。在体外适当机械刺激下,BMSCs增殖、分化等生物学特性发生功能性变化,对力学刺激做出适应性应答。LMHFV可促进BMSCs向成骨细胞分化,探明其机制有助于将微振动应用于骨质疏松、骨折、成骨不全症、肥胖症等疾病的治疗以及正畸牙移动的加速等方面。综述微振动对BMSCs成骨向分化的影响以及可能的作用机制,为研究微振动刺激下BMSCs的力学生物学改变提供思路。

Prrx1+牙周膜干细胞在牙移动过程中的谱系示踪

目的·通过Cre/loxP重组酶系统研究牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)中配对相关同源基因1(paired related homeobox 1,Prrx1)阳性细胞谱系(Prrx1+细胞谱系)在小鼠牙移动过程中的动态分布。方法·利用Cre/loxP重组酶系统,将诱导型Prrx1-Cre^(ERT2)小鼠与R26^(tdTomato)荧光标记小鼠交配繁殖,并通过PCR对其子代小鼠进行基因型鉴定。取8只子代小鼠,向其腹腔注射他莫昔芬(tamoxifen,TA),以标记PDLSCs中的Prrx1+细胞谱系(即tdTomato^(+)细胞)。于小鼠上颌左侧安置加力装置[即正畸牙移动(orthodontics tooth movement,OTM)侧],右侧未加力即为对照侧,以构建小鼠OTM模型。分别于牙移动第3日(OTM 3 d)、第7日(OTM 7 d)时处死小鼠,收集其双侧上颌磨牙及周围牙周组织,经脱钙后行包埋及冰冻切片处理。采用苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,H-E染色)观察张力区和压力区牙周膜的改变,并利用免疫荧光染色观察Prrx1+细胞谱系在张力区及压力区的动态分布。结果·经PCR鉴定,子代小鼠基因型为Prrx1-Cre^(ERT2);R26^(tdTomato)。随着加力装置作用的增加,OTM 7 d小鼠的牙移动距离[(87.44±4.02)μm]较OTM 3 d小鼠[(42.81±5.04)μm]明显增加,提示小鼠OTM模型构建成功。H-E染色结果显示:OTM 3 d时小鼠OTM侧压力区的牙周膜被压缩、间隙变窄,而OTM 7 d时OTM侧牙周膜宽度逐渐恢复;OTM 3 d时OTM侧张力区的牙周膜被拉伸,而OTM 7 d较OTM 3 d时牙周膜排列更规则。免疫荧光染色结果显示:OTM 3 d时OTM侧压力区牙周膜中tdTomato^(+)细胞数量较对照侧减少,OTM 7 d时OTM侧压力区tdTomato^(+)细胞数量较对照侧增加(均P<0.05);OTM 3 d及OTM 7 d时,OTM侧张力区tdTomato^(+)细胞数量较对照侧均有增加(均P<0.05)。结论·成功构建了Prrx1-Cre^(ERT2);R26^(tdTomato)小鼠的OTM模型,并初步证实了Prrx1+细胞谱系参与OTM过程中的牙周改建。

“以疾病为导向的数字化教学模式”在口腔医学本科教学中的应用

目的探讨“以疾病为导向的数字化教学模式”在口腔医学本科教学中的应用效果。方法选取2018级34名临床医学本科生为对照组1,2015级24名口腔医学本科生为对照组2,2018级23名口腔医学本科生为实验组。对照组均接受传统教学模式,实验组接受一学年“以疾病为导向的数字化教学模式”。最后,通过问卷调查和难度较低的口腔专业题目测试进行教学效果评价。采用SPSS 24.0进行t检验。结果接受该教学模式后学生对于“机体”和“疾病”概念的清晰程度均有改进(P<0.05),且对于该教学法的评价均为正向。通过较低难度的专业知识测试发现,实验组测试成绩[(42.17±1.21)分]高于同年级非口腔专业学生[(24.71±1.42)分],差异有统计学意义(P<0.05),与高年级口腔专业学生测试成绩[(43.33±1.30)分]差异无统计学意义(P>0.05)。结论该教学模式使学生在进入分散的专业课程学习之前首先建立起“机体”的概念,形成以疾病为导向的知识框架,进一步激发低年级学生对所学专业的兴趣,对其专业意识具有良好的引领作用,是教学医院在低年级本科生课堂教学之外进行的有益探索。