华山松对疱锈菌感性遗传分析的ISSR-PCR反应体系建立及引物筛选

用采自云南华山松疱锈病3个典型发病点的华山松植株样品,组成健康株组和感病株组进行ISSR-PCR反应体系的建立和引物筛选.构建的华山松ISSR-PCR最优反应体系为:反应总体积25μL,其中含10×Buffer2.5μL,Taq DNApolymerase 0.3μL(终浓度1.5 U),Primer2.0μL(终浓度2.0μmol/L),DNA Template 5.0μL(终浓度1.5 ng/μL),Mg2+2.5μL(终浓度2.5 mmol/L),dNTP2.5μL(终浓度250μmol/L),ddH2O10.2μL.扩增反应程序为:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,47℃左右退火45 s,72℃延伸2 min,40个循环,最后在72℃F继续延伸10 min.通过初筛和中试筛选出扩增反应清晰、扩增稳定的10个引物作扩大实验,在健康株组和感病株组的两个DNA pool之间有明显的PCR扩增条带多态性.筛选出的ISSR引物可提供研究华山松种群差异的遗传标记.