贵州省2株牛种布鲁氏菌分子流行病学特征分析

目的分析贵州省牛种布鲁氏菌分子流行病学特征,为牛种布鲁氏菌病疫情的防控提供科学依据。方法采用BCSP31-PCR及AMOS-PCR技术对经传统方法鉴定为牛种布鲁氏菌的2株分离株进行属/种复核,采用基于布鲁氏菌rpoB基因的单核苷酸多态性分析了解其rpoB基因型,采用MLVA-16技术进行MLVA分型,了解其与国内牛种布鲁氏菌的聚类关系,采用MLST技术分析其序列型及其与国内菌株间的遗传进化关系。结果2株分离株经BCSP31-PCR和AMOS-PCR技术被鉴定为布鲁氏菌属细菌,未能明确其具体种型;其rpoB基因型相同;MLVA分型与新疆牛种布鲁氏菌共享同一MLVA-16型(4-5-3-12-2-2-3-1-6-43-8-5-5-5-3-3);MLST分析鉴定2株菌均为ST2型,最小间距图显示2株菌与布鲁氏菌属内的牛种布鲁氏菌遗传距离最近,属同一个遗传复合体。结论贵州省2株牛种布鲁氏菌分离株间的遗传距离近,与新疆牛种3型布鲁氏菌为同一MLVA型,提示分离株引起的感染可能为外省输入。

2021年贵州省一起人间钩端螺旋体病疫情的分子流行病学调查分析

目的对2021年贵州省一起疑似钩端螺旋体病(钩体病)疫情开展病原学调查和分子流行病学分析,为病例的确诊和疫情防控提供科学依据。方法对收集的疑似钩体病例全血样本进行分离培养和致病性钩体特异性PCR检测,同时采用显微镜凝集试验(MAT)对病例血清进行钩体抗体检测。采用“夹夜法”捕捉疫区鼠类宿主动物,取肾脏进行钩体分离培养,采用致病性钩体特异性PCR进行检测,进一步采用血清群特异PCR进行鉴定。应用多位点序列分析(MLST)对本起疫情菌株进行基因分型,构建聚类分析图谱,分析其与国内菌株间的遗传和进化关系。结果3份疑似钩体病例样本经分离培养均为阴性,MAT试验分别为黄疸出血群、秋季群和爪哇群抗体阳性,经致病性钩体特异性PCR检出1例阳性。从鼠类宿主动物样本中分离出6株疑似钩体菌株,经鉴定分别为黄疸出血群(5/6)和秋季群菌株(1/6)。MLST分析显示,鼠类宿主动物携带的5株钩体为ST1型(83.33%),另1株为ST129型(16.67%)。聚类分析显示,鼠类宿主动物携带钩体与四川省、湖南省、江西省和贵州省往年菌株存在同一ST型。结论本起疫情是由致病性钩体感染引起,优势血清群和ST型与本省和周边省份往年分离株一致。秋季群菌株为贵州省近年来首次发现的钩体血清群,当地应加强监测以更好地预防和控制钩体病。

贵州省2013-2021年羊种布鲁氏菌分离株的多位点可变数目串联重复序列分析

目的了解贵州省2013-2021年羊种布鲁氏菌的分子流行病学特征,为贵州省布鲁氏菌病疫情防控提供科学依据。方法以贵州省疾病预防控制中心2013-2021年分离、鉴定和保存的78株羊种布鲁氏菌分离株为研究对象,运用BCSP31-PCR及AMOS-PCR技术对分离株分别进行布鲁氏菌属及种的鉴定,运用多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA-16)技术进行分型分析。对MLVA分型结果进行整理及聚类分析,了解贵州省羊种布鲁氏菌的MLVA型别分布及分子流行病学特征。结果78株羊种菌分离株经BCSP31-PCR技术均鉴定为布鲁氏菌属细菌,AMOS-PCR技术将其均鉴定为羊种布鲁氏菌,MLVA-8分型技术将其分为5种MLVA型,MLVA-16分型技术将其分为46种MLVA型,其中遵义市的MLVA-16基因型型别分布最多。基于MLVA-16分型数据聚类分析显示,78株分离株亲缘关系较近,被聚类为4个群;最小生成树图显示,78株分离株被分为8个遗传复合体和14个单体。结论贵州省羊种布鲁氏菌MLVA型别呈多样性,提示贵州省布病疫情的病原体可能存在多条传播链。

2017-2021年贵州省布鲁氏菌分离株的多位点序列分型基因特征

目的了解贵州省布鲁氏菌分离株的多位点序列分型(multi-locus sequence typing,MLST)基因特征。方法以2017-2021年贵州省布鲁氏菌分离株(保存于贵州省疾病预防控制中心菌毒种库)为研究对象,应用BCSP31-PCR方法进行布鲁氏菌属特异性鉴定,AMOS-PCR方法进行布鲁氏菌种/型鉴定;应用MLST方法进行基因分型,并采用Bionumerics 8.0软件对分型结果进行聚类分析。结果贵州省分离的32株布鲁氏菌,经BCSP31-PCR方法和AMOS-PCR方法鉴定为羊种布鲁氏菌;经MLST方法分析,可以分为2种ST型(ST8、ST39型),其中ST8型28株(87.5%)、ST39型4株(12.5%)。ST8型菌株分布在省内7个市(州),ST39型菌株仅在黔西南布依族苗族自治州发现。聚类分析结果显示,ST8、ST39型菌株与羊种布鲁氏菌参考株聚在1个群内,且ST39型与ST8型菌株仅在glk基因内存在1个核苷酸位点差异,亲缘关系较近。结论羊种布鲁氏菌是近年来贵州省布鲁氏菌病疫情的主要病原体,ST8型是贵州省羊种布鲁氏菌的优势MLST基因型。

2021年贵州省环境致病性钩端螺旋体分离培养及基因种分析

目的对贵州省2021年钩端螺旋体(钩体)病疫区环境标本进行致病性钩体分离培养,了解其基因种特征,为钩体病防控提供科学依据。方法采集钩体病疫情发生地环境水和土壤样品,采用EMJH培养基进行钩体分离培养。提取疑似钩体生长培养物基因组DNA,采用致病性钩体特异性PCR进行检测,同时采用16S rRNA序列分析法对其进行基因种鉴定,并应用MEGA 7.0软件构建系统发育树,分析菌株间进化关系。结果从112份环境样品中分离出50株疑似钩体菌株,致病性钩体特异性PCR检测显示其中3株为致病性钩体,包含环境水样分离出的2株和土壤样品中分离出的1株。16S rRNA序列比对分析显示,经PCR检测为致病性钩体的3株菌株属于钩体致病性基因种,其中2株为Leptospira noguchii基因种,1株为Leptospira borgpetersenii基因种;另外47株菌株中5株菌株属于钩体中间种,42株菌株属于钩体非致病性基因种。系统发育树显示,致病性钩体菌株与其基因种代表性菌株进化关系较近。结论贵州省钩体病疫区环境钩体基因种复杂,同时存在致病性基因种和非致病性基因种,本次检出的2种致病性钩体基因种为贵州省尚未报道的基因种,可为贵州省钩体病疫情防控提供科学依据。

结核分枝杆菌双靶标环介导恒温扩增检测方法的建立与应用

目的建立基于双靶标环介导恒温扩增(LAMP)的结核分枝杆菌(MTB)检测技术并应用于临床。方法以结核分枝杆菌复合群(MTBC)插入序列IS6110和MTB mtp40基因为检测靶标,分别设计1套LAMP引物。通过引物浓度和反应条件优化,建立基于双靶标的检测方法(mtp40-LAMP和IS6110-LAMP),比较2种方法的灵敏度和特异性。应用建立的mtp40-LAMP和IS6110-LAMP方法与PCR、萋-尼氏抗酸染色法和分枝杆菌分离培养法,分别对55例患者的痰标本进行检测与鉴定,通过对其结果的比较分析评价mtp40-LAMP和IS6110-LAMP方法的实用性。结果灵敏度试验显示,mtp40-LAMP和IS6110-LAMP方法可检出MTB基因组DNA最低浓度为125fg/μl,比常规的PCR方法高10~100倍。mtp40-LAMP和IS6110-LAMP方法的特异性为100%,能检测MTB菌株并能从MTBC中鉴别MTB。痰标本检测显示,IS6110-LAMP与PNB鉴定结果一致性检验的Kappa值为0.881(P<0.01),mtp40-LAMP与TCH鉴定结果的Kappa值为0.887(P<0.01)。与PCR方法和萋-尼氏抗酸染色法检测结果比较,mtp40-LAMP和IS6110-LAMP方法敏感性更高。反应体系中加入MG指示剂可直接通过肉眼观察颜色变化进行结果判定,实现了快速闭管检测。从样本处理(35min)、扩增反应(40min)到结果验证(1~2min),整个检测过程80min内即可完成。结论基于LAMP技术建立的mtp40-LAMP和IS6110-LAMP双靶标检测方法敏感性高、特异性强,能够快速、准确地检测和鉴别MTB,可作为潜在的MTB快速筛查或诊断工具。

贵州省一起布鲁氏菌病聚集性疫情的病原学调查与分子流行病学分析

目的对2021年贵州省一起疑似布鲁氏菌病聚集性疫情开展病原学调查和分子流行病学分析。方法采用血培养法从疑似感染布鲁氏菌病的患者和病羊的血液分离布鲁氏菌,分别运用BCSP31-PCR和AMOS-PCR对疑似菌株进行布鲁氏菌属及种/型的鉴定,应用多位点可变数目串联重复序列(MLVA-16)分析技术对其进行分子分型,将MLVA分型结果与近年来贵州省及国内各地布鲁氏菌代表株进行聚类分析,了解菌株间的聚类关系。结果从16份疑似患者全血标本分离出5株疑似布鲁氏菌,从19份疑似病羊全血标分离出1株疑似布鲁氏菌,BCSP31-PCR将6株疑似菌均鉴定为布鲁氏菌属细菌,AMOS-PCR其均鉴定为羊种布鲁氏菌。MLVA-16分析显示6株疫情菌株被分为3种MLVA型,其中来自患者的分离株GZ-QN 1、GZ-QN 4及GZ-QN 6共享MLVA型1(1-5-3-13-2-2-3-2-4-20-8-7-4-3-4-6),来自1患者分离株GZ-QN 8与来自1病羊分离株株GZ-QN A691共享MLVA型2(1-5-3-13-2-2-3-2-4-20-8-8-4-3-6-6),来自1患者分离株GZ-QN 14为独立的MLVA型3(1-5-3-13-2-2-3-2-4-20-8-8-4-3-7-6)。基于MLVA-16分型数据聚类显示,引起贵州省本起疫情的布鲁氏菌与羊种生物3型菌株聚类较近,且与来自福建、新疆的布鲁氏菌聚在同一小分支。结论引起本起疫情病原体为的羊种布鲁氏菌且具有MLVA型别多样性,可能为与福建、新疆等地的羊种布鲁氏菌菌株具有关联的输入性感染引起的聚集性疫情。

2017-2019年贵州省结核分枝杆菌多位点序列分析及与耐药的相关性

目的了解贵州省2017-2019年结核分枝杆菌分离株的等位基因型别特征及其与耐药的相关性,为贵州省结核病的防治提供科学依据。方法收集贵州省毕节市、安顺市、仁怀市和威宁县4个国家级结核病耐药监测点2017-2019年分离的52株结核分枝杆菌,采用基于7个管家基因位点(recX、rpsl、rmlC、rpmG1、mprA、gcvH、ideR)的MLSA技术进行ST分型。选用异烟肼(INH)、链霉素(SM)、乙胺丁醇(EMB)、利福平(RFP)、卡那霉素(KAM)和氧氟沙星(OFX)6种抗结核药物对52株结核分枝杆菌进行药敏试验,分析菌株耐药与ST型别的相关性。结果52株结核分枝杆菌经MLSA分为11个ST型,其中优势ST型为ST11型(占32.7%)、ST1(占23.1%)和ST5型(占15.4%)。药敏试验显示,52株结核分枝杆菌总耐药率为42.3%(22/52),其中单耐药率为15.4%(8/52),耐多药率为19.2%(10/52),多耐药率为3.8%(2/52)。基于7个管家基因位点的聚类分析和最小间距图分析结果显示,ST2、ST4和ST6型菌株全部为敏感菌株,ST7和ST8型菌株均为多耐药菌株,ST9型菌株均为耐多药菌株,其余ST型由耐药和敏感菌株构成。结论贵州省2017-2019年结核分枝杆菌以ST11、ST1和ST5型为主,ST型呈现多样性。菌株以单耐药和耐多药为主,ST型与耐药具有一定的相关性。

黄疸出血群钩端螺旋体LAMP-LFB快速检测方法的建立与应用

目的基于环介导恒温扩增(LAMP)结合纳米生物传感条(LFB)技术,建立并评价黄疸出血群钩端螺旋体(钩体)的LAMP-LFB快速检测方法。方法以黄疸出血群钩体O抗原基因簇中的糖基转移酶基因(gtf)为检测靶标并设计特异性LAMP引物。通过对LAMP引物的特定标记(FIP-FAM和LF-Biotin)和优化试验,建立LAMP-LFB快速检测方法,并分析其灵敏度和特异性。应用建立的LAMP-LFB、普通PCR方法和显微凝集试验(MAT),分别对53株钩体分离菌株进行鉴定,比较分析鉴定结果并评价LAMP-LFB方法的实用性。结果灵敏度和特异性试验显示,LAMP-LFB方法可检出黄疸出血群赖型56601基因组DNA的最低浓度为100 fg/μL,检测特异性为100%,与其余血清群和非钩体菌株核酸无交叉反应。菌株鉴定结果显示,LAMP-LFB与MAT鉴定结果完全一致,符合率为100%,其敏感性高于PCR方法。此外,LAMP扩增产物经LFB验证,可直接通过观察检测线(TL)和质控线(CL)进行结果判定。结论基于gtf基因建立的LAMP-LFB检测技术方便、快捷且重复性好,可快速、灵敏、特异地鉴定黄疸出血群钩体菌株,能够作为有价值的黄疸出血群钩体菌株快速鉴别或诊断方法。

Caspase-4非经典炎症小体对问号钩体诱导THP-1细胞炎症因子分泌水平的影响

目的了解Caspase-4非经典炎症小体在问号钩体诱导THP-1细胞炎性细胞因子分泌过程中的作用。方法采用问号钩体感染THP-1细胞(预先经佛波酯刺激分化为巨噬细胞)建立细胞模型,用实时荧光PCR扩增检测caspase-4、IL-18、IL-1β和IL-1αmRNA水平,Western blotting检测Caspase-4蛋白表达,ELISA定量检测细胞上清中IL-18、IL-1β和IL-1α分泌情况。结果实时荧光PCR和Western blotting显示,与未感染细胞比较,THP-1细胞Caspase-4 mRNA及蛋白表达水平均升高(t=46.03、29.36,均P<0.05),Caspase-4 siRNA转染后,Caspase-4 mRNA及蛋白表达水平显著下降(t=32.48、30.77,均P<0.01);钩体感染后,IL-18、IL-1β和IL-1αmRNA水平显著升高(t=25.70、26.13、19.94,均P<0.05),在Caspase-4特异性阻断后显著下降(t=11.55、44.68、15.68,均P<0.05);ELISA检测显示,钩体感染后,IL-18、IL-1β和IL-1α分泌均显著升高(t=50.24、34.17、25.18,均P<0.05),且能被Caspase-4特异性阻断剂有效抑制(t=42.00、17.07、5.03,均P<0.05)。结论Caspase-4非经典炎症小体参与介导问号钩体诱导人单核-巨噬细胞炎性细胞因子IL-18、IL-1β和IL-1α的分泌。