金黄色葡萄球菌对体外保存猪精子活力及蛋白磷酸化修饰的影响

旨在从精子代谢及蛋白磷酸化修饰水平探讨金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)对猪精液17℃保存过程中精子活力的影响,从而为病原菌影响猪精子质量的分子机制研究提供理论基础。本研究采用计算机辅助精子活力分析仪(CASA)及试剂盒测定精子运动性能,3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)活性、环化腺苷一磷酸(cAMP)水平及ATP总量变化,利用Western blot及细胞免疫荧光技术分别检测精子蛋白磷酸化水平变化及磷酸化修饰蛋白亚细胞定位。CASA结果显示,猪精液体外17℃保存过程中,10~3 CFU·mL^(-1)的金黄色葡萄球菌显著降低精子运动性能(P<0.05),培养3d后,随着葡萄球菌增加,猪精子运动性能降低趋势更显著(P<0.01);与精子活力参数相类似,培养3d后,处理组细胞内GAPDH活性及ATP总量显著低于对照组(P<0.05);Western blot结果表明,处理组精子蛋白磷酸化水平与对照组相比存在显著性差异(P<0.05),磷酸化修饰水平变化与cAMP变化具有一致性,预示着金黄色葡萄球菌对精子蛋白磷酸化修饰变化的影响可能遵循sAC-cAMP-PKA信号通路。综上表明,金黄色葡萄球菌抑制糖代谢GAPDH活性,从而降低ATP水平,同时可能遵循sAC-cAMP-PKA信号通路抑制头部核后区、赤道段及鞭毛区与精子活力相关蛋白的磷酸化水平,从而抑制猪精子活力。

培养液pH值对小鼠精子体外培养过程中活力及蛋白修饰的影响

为了探究不同pH对小鼠成熟精子体外培养过程中活力参数及蛋白修饰的影响，研究采用不同pH值（6．6～7．8）培养液培养小鼠精子2h，利用计算机辅助精子活力分析仪（CAsA）、蛋白免疫印迹（WB）及免疫荧光技术，分析测定小鼠精子活力参数、蛋白修饰的变化情况，并对小鼠精子磷酸化蛋白及乙酰化蛋白进行细胞亚组分定位。结果显示，pH为7．2～7．4时精子能动性（spermmotility，MOT）、平均路径速度（pathvelocity，VAP）、平均直线运动速度（straightlinevelocity，VSL）和平均曲线运动速度（curvilinearveiocity，VCL）都有较高值，pH为6．6或7．8时精子活力受到显著抑制（Pd0．05）；培养液的pH为7．4处理组，小鼠精子蛋白磷酸化、乙酰化和琥珀酰化修饰均达到较高水平，无论pH降低（〈7．2）还是升高（〉7．4）这些蛋白修饰水平都减弱，与精子活力参数变化趋势一致；免疫荧光定位结果显示，获能组磷酸化蛋白及乙酰化蛋白荧光强度明显高于未获能组，磷酸化蛋白及乙酰化蛋白遍布精子整个鞭毛区域，其中头部核区蛋白乙酰化修饰水平较高。上述研究表明pH值7．2～7．4为小鼠精子体外培养的最适pH值范围，pH值可能通过影响精子体外培养过程中的蛋白磷酸化、乙酰化及琥珀酰化作用调节精子活力及功能。本研究对探究pH值调控哺乳动物成熟精子活力的分子机理及体外培养具有重要意义。

小鼠精子体外培养过程中Ca^(2+)对微管蛋白乙酰化的影响

微管蛋白的乙酰化作用对细胞代谢过程,维持细胞的稳定性及运动性具有特殊作用,而有关哺乳动物精子蛋白乙酰化修饰的研究报道较少,且成熟精子蛋白乙酰化作用机制尚未明确。本研究利用精子活力参数计算机辅助检测(CASA)技术、蛋白免疫印迹(WB)以及免疫荧光等实验技术,分析测定小鼠精子体外培养过程中,不同浓度Ca2+以及HCO-3、环腺苷酸(dbcAMP)等精子获能调节因子对微管蛋白乙酰化的影响。结果表明,小鼠精子中分子量约为55、37、26kDa微管蛋白发生乙酰化修饰,获能培养后微管蛋白乙酰化程度明显高于未获能培养;钙离子对精子运动能力以及微管蛋白乙酰化修饰起双重调节作用,低浓度Ca2+(≤2.0mmol/L)促进精子活力及微管蛋白乙酰化(P<0.05),而高浓度Ca2+(4.0mmol/L)明显抑制精子活力MOT(48.88%)、曲线运动速度VCL(99.46μm/s)及微管蛋白乙酰化(P<0.05);加入钙离子级联信号调节因子钙调蛋白抑制剂(W7)和钙调蛋白激酶抑制剂(KN-93),能有效缓解高浓度Ca2+(4.0mmol/L)对微管蛋白乙酰化的抑制作用,而钙离子载体(A23187)能进一步增强高浓度Ca2+对小鼠精子微管蛋白乙酰化的抑制作用;dbcAMP、异丁基黄嘌呤(IBMX)及PKA抑制剂(H-89)等cAMP-PKA磷酸化信号因子影响微管蛋白乙酰化,但不符合cAMP-PKA磷酸化信号通路调节规律。免疫荧光结果显示乙酰化微管蛋白主要分布在精子尾部的中段和主段,且主段最为明显。本研究提示Ca2+可能通过调节微管蛋白的乙酰化,从而影响精子的活力及受精能力。

NAC抑制镉离子诱导的小鼠精子DLD酪氨酸磷酸化作用

重金属镉是环境中广泛存在的污染物,对机体生殖系统有很强的毒性作用。镉能诱导精子细胞蛋白二氢硫辛酰胺脱氢酶(DLD)发生酪氨酸磷酸化修饰,但机制尚不清楚。本研究利用蛋白免疫印迹技术探讨镉离子对小鼠生殖系统的毒性作用、镉诱导生殖细胞蛋白发生酪氨酸磷酸化修饰的机理及抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)对精子的保护作用。结果表明,镉离子能减弱生殖细胞的能量代谢水平,从而抑制睾丸的生长发育并导致产仔数下降;镉离子能特异性诱导精子DLD蛋白发生酪氨酸磷酸化修饰,且与钙离子具有协同作用。此外,NAC可在体外有效抑制DLD蛋白发生酪氨酸磷酸化从而抑制镉的生殖毒性,并恢复精子能量水平和活力参数。本研究从NAC抑制镉离子诱导特异性蛋白磷酸化修饰的角度,揭示NAC保护作用机制,旨在为镉离子生殖毒理学研究及疾病防治提供理论基础。

组蛋白赖氨酸巴豆酰化修饰的研究进展

组蛋白赖氨酸巴豆酰化修饰是2011年新发现的一种酰化修饰,对基因表达、细胞发育以及疾病治疗等生物过程具有重要的生物学意义。近两年内,巴豆酰化修饰生化相关研究取得突破性进展,尤其是在蛋白巴豆酰化修饰的生理功能以及与发育、遗传、疾病相关性等领域逐渐受到关注。现对蛋白巴豆酰化做一简要回顾,总结组蛋白巴豆酰化修饰鉴定、相关酶系统、识别结构域及生物学功能等,这些信息为将来进一步探索蛋白巴豆酰化的功能提供理论基础。

镉对小鼠精子蛋白酪氨酸磷酸化修饰的影响及EGTA的保护作用

采用体外培养的方法,利用精子活力分析软件(CASA)、蛋白免疫印迹(WB)及免疫荧光技术,探讨镉(Cd)对小鼠精子活力参数、蛋白酪氨酸磷酸化修饰的影响,并对小鼠精子酪氨酸磷酸化蛋白进行细胞亚组分定位.结果表明:Cd对小鼠精子活力具有明显抑制作用,且随着Cd浓度的增加抑制作用增强,当Cd浓度达到1.0μmol·L^(-1)时,小鼠精子活力(MOT)显著低于对照组;同时,Cd促进小鼠精子蛋白酪氨酸磷酸化,当浓度≥1.0μmol·L^(-1)时,尤其分子量约为55 kDa的蛋白酪氨酸磷酸化程度显著增强,且免疫荧光结果显示主要集中在小鼠精子中段;当用30μmol·L^(-1)乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)和10μmol·L^(-1)Cd同时培养时,55 kDa蛋白并未发生明显的酪氨酸磷酸化修饰,而且小鼠精子活力变化不显著.表明Cd可能是通过诱导中段55 kDa蛋白发生酪氨酸磷酸化修饰从而抑制精子活力,EGTA能螯合Cd离子并有效防止其毒性作用.研究证实,Cd诱导精子特异性蛋白酪氨酸磷酸化增强,进而抑制精子活力.EGTA可以用于体外控制Cd进入细胞的阻断剂,为Cd繁殖毒性分子机制的研究提供了研究手段.