IRES核心区12-bp非连续插入突变对猪塞内卡病毒复制和细胞嗜性的影响

【背景】塞内卡病毒(senecavirus A,SVA)是新近暴发的一种引起猪特发性水疱病及仔猪死亡的小核糖核酸病毒。该病毒基因组5′非编码区(untranslated region,UTR)中的内部核糖体进入位点(IRES)元件在病毒复制过程中发挥重要作用。2017年我国出现IRES核心区Domain II 12个碱基非连续插入的自然突变SVA毒株,在病毒复制和致病性方面存在明显改变。【目的】探讨IRES Domain II区域发生的突变对SVA的复制及细胞嗜性的影响,为进一步了解SVA致病机制奠定基础。【方法】以实验室前期构建的含HeN-1/2018株全基因组感染性克隆pHeN-1/2018为基础,通过定点突变的方式,逐步将其IRES Domain II核心区域308—317 nt的9个碱基(ACTCAAGCG)替换为GD04/2017株基因组308—328 nt的21个碱基(CACGCCTGCCGATAGACGATT),构建重组载体pHeN-1/2018-i12并进行了病毒拯救。随后,利用病毒基因组克隆测序、间接免疫荧光试验和Western blot试验对所拯救病毒进行鉴定,同时验证了IRES核心区12个碱基插入突变对SVA病毒体外复制能力和细胞嗜性的影响。【结果】将构建完成的重组载体pHeN-1/2018-i12转染细胞,盲传至P2代,获得致使感染细胞病变明显、病变时间稳定的IRES突变病毒rHeN-1/2018-i12。病毒连续传代后测序结果表明rHeN-1/2018-i12遗传稳定,P5代病毒基因组序列未发生碱基突变,P10代病毒IRES区域没有出现突变现象。用低代次的突变病毒rHeN-1/2018-i12体外感染本体动物猪源细胞系PK-15和IBRS-2,及仓鼠源细胞系BHK-21,进行细胞感染试验,结果表明rHeN-1/2018-i12与亲本毒株rHeN-1/2018在PK-15、IBRS-2和BHK-21中均能导致明显的细胞病变,表现出相似的生长曲线趋势,表明IRES核心区Domain II 12个碱基突变不能够改变对上述细胞的嗜性;但SVA突变病毒和亲本株在不同细胞中的病变时间及病毒滴度上存在较大的差异,rHeN-1/2018-i12株在细胞中生长能力较其亲本株rHeN-1/2018差,诱使细胞病变的时间较晚,在感染24 hpi,两者病毒滴度相差可达10倍。【结论】本研究基于SVA反向遗传操作系统构建并拯救SVA IRES突变毒株,确定了IRES突变对SVA生物学特性的影响,有助于我们更好地了解SVA致病机制,拓宽我们对病毒IV型IRES功能的认识。

盖塔病毒SC483株cDNA感染性克隆的构建

【背景】盖塔病毒(Getah virus,GETV)是一种由蚊虫传播的病毒,分类学上属于披膜病毒科甲病毒属成员。该病毒宿主范围广,可感染猪、马、牛、狐狸等多种哺乳动物,人也可以感染,但在人群中造成的危害尚不知晓。动物感染主要临床表现为发热、皮疹、关节炎、繁殖障碍和死胎。GETV在世界范围内流行较为广泛,近年来在我国的流行呈上升趋势,2018年我国南方多个猪场爆发该病,GETV在畜禽养殖及公共卫生方面的危害渐渐受到人们的关注。目前,尚无用于预防和治疗盖塔病毒感染的商业化疫苗和药物。由于对GETV研究较少,其生物学特性、对不同物种的致病性和致病机制以及流行趋势在很大程度上均是未知的。【目的】建立高效的GETV反向遗传操作平台,为深入研究GETV基因组结构与功能、致病机制以及开发新型疫苗奠定基础。【方法】采取化学合成的方式人工合成了两端分别含有锤头状核酶(HamRz)和丁肝病毒核酶(HdvRz)序列的GETV SC483株基因组全长,并克隆至低拷贝pOK12-CMV载体中,从而获得含有GETV SC483株基因组全长cDNA克隆的重组质粒pGETV-SC483。将纯化的重组质粒pGETV-SC483转染BHK-21细胞进行病毒拯救。对拯救病毒进行连续传代、鉴定以及生物学特性分析,并对感染性克隆质粒pGETV-SC483在大肠杆菌中的遗传稳定性进行验证。【结果】重组质粒pGETV-SC483转染BHK-21细胞后,48 h即可观察到GETV感染引起的典型细胞病变,获得的拯救病毒命名为rSC483。分别提取拯救病毒和亲本病毒基因组RNA,对病毒基因组进行RT-PCR扩增、Not I酶切以及序列测定。结果表明,拯救病毒不同于亲本病毒,其含有人为引入以消去Not I酶切位点的G4332A突变的分子标记。使用GETV特异性抗体作为检测抗体的间接免疫荧光试验和病毒粒子形态学电镜负染观察结果进一步表明,GETV拯救成功。噬斑形成试验和一步生长曲线试验结果表明,拯救病毒与亲本病毒具有相似的复制能力和增殖特性。另外,感染性克隆质粒pGETV-SC483在大肠杆菌DH5α中连续传代后的测序结果表明,该重组质粒具有良好的遗传稳定性。【结论】成功构建了稳定、高效的GETV SC483株全长cDNA感染性克隆,为GETV生物学特性及致病机理研究以及新型疫苗开发提供了技术平台。

猫杯状病毒HRB-SS株感染性cDNA克隆的构建与病毒的拯救

为构建猫杯状病毒(FCV)HRB-SS株的感染性克隆,本研究合成3’端含有丁肝病毒核酶(HdvRz)序列的HRB-SS株全长基因组序列,将该序列插入p OK12-CMV载体,获得含FCV HRB-SS全长基因组cDNA克隆的重组质粒p FCV-HRB-SS。将重组质粒p FCV-HRB-SS转染猫肾细胞(CRFK),48 h即可观察到典型细胞病变,将病变细胞的上清接种未感染的CRFK细胞进行传代培养,连续传5代,从感染的细胞上清中获得拯救病毒。采用FCV VP1蛋白MAb,经间接免疫荧光试验检测,结果显示拯救病毒与亲本病毒均可观察到特异性绿色荧光,而未感染病毒的对照组细胞无荧光信号;各组细胞负染色后经电镜观察均可见病毒粒子呈典型的杯状结构。提取拯救病毒和亲本病毒基因组RNA,反转录为c DNA作为模板,经RT-PCR扩增、Kpn I酶切鉴定及测序分析,结果显示,拯救病毒含C^(5724)G位点突变的分子标记,消除了Kpn I酶切位点,不同于亲本病毒。上述结果表明获得拯救病毒r FCV HRB-SS。采用蚀斑形成试验和绘制病毒的一步生长曲线进一步检测r FCV HRB-SS,结果显示,r FCV HRB-SS与亲本病毒具有一致的复制水平和体外生长能力。本研究利用真核启动子构建的FCV HRB-SS株全长感染性cDNA克隆系统可直接在细胞内转录,减少了体外操作流程,有效防止了操作污染,具有操作简便,拯救效率高的优势,为后续FCV基因功能的研究和新型疫苗的研发奠定了基础。

基于盖他病毒nsP3基因的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种灵敏、特异且高效的检测盖他病毒(GETV)的TaqMan荧光定量RT-PCR方法,本研究根据GETV的nsP3基因设计特异性引物及探针,以GETV (SC483株) cDNA作为模板,扩增目的基因并克隆至p ET-29a载体中,构建重组质粒标准品p ET29a-nsP3并经PCR和测序鉴定。基于该质粒标准品,采用方阵法优化引物、探针浓度以及退火温度,初步建立了一种基于GETV nsP3基因的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法,并绘制标准曲线。以GETV (SC483株、SC266株)、辛德毕斯病毒(SINV)、猪流感病毒(H3N2、SIV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)等病毒的基因组RNA反转录为cDNA作为模板,利用本实验建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法检测,结果显示,仅GETV为阳性,SINV、SIV、TGEV、PEDV、PRRSV均为阴性,表明该方法特异性较强;分别以10倍倍比稀释(3.07×10^(-1)拷贝/μL~3.07×10^(8)拷贝/μL)的重组质粒标准品p ET29a-nsP3作为模板,利用本研究建立的方法和普通RT-PCR方法分别检测,结果显示,本研究建立的方法对重组质粒标准品的检测限为30.7拷贝/μL,敏感性是普通RT-PCR的100倍,敏感性较高;分别以同一时间及不同时间提取的不同浓度的质粒标准品作为模板,利用本研究建立的荧光定量RT-PCR进行组内与组间的重复性试验检测,结果显示,该方法的组内组间变异系数均小于2%,重复性较好。利用本实验建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法与普通RT-PCR方法分别对来源于GETV感染小鼠的84份组织样品中的病毒核酸进行检测,结果显示,该TaqMan荧光定量RT-PCR方法对GETV检出率为95.24%(80/84),而普通RT-PCR对GETV的检出率为67.86%(57/84)。二者的阳性符合率达100%。本研究首次基于GETV nsP3基因建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法,该方法特异性强、敏感性高、重复性好,为GETV的检测提供了有效工具。

O型泛亚谱系口蹄疫病毒cDNA感染性克隆的建立

本研究采用RT-PCR技术将O型口蹄疫病毒(FMDV)O/YS/CHA/05株全长基因组分4个cDNA片段进行克隆、拼接,构建了具有感染性的FMDV cDNA克隆pOKT7-O/YS/CHA/05。将线性化的pOKT7-O/YS/CHA/05在细胞外转录获得的病毒RNA转染BHK-21细胞,经培养可见典型的细胞病变(CPE)。同时,将线性化的pOKT7-O/YS/CHA/05与含有编码T7 RNA聚合酶的真核表达重组质粒共转染BHK-21细胞,同样也观察到典型的CPE。对拯救的病毒进行RT-PCR扩增、酶切和序列分析鉴定表明,拯救病毒含有不同于亲本病毒的分子标记,即在病毒核酸的3510位人工消除了XbaⅠ酶切位点。免疫电镜观察和间接免疫荧光试验进一步表明,拯救出了FMDV。病毒生长比较试验表明,拯救病毒与亲本病毒具有相似的增殖特性。本研究构建了O型口蹄疫病毒的感染性克隆并获得了拯救病毒,为深入研究FMDV的致病机理以及开发新型疫苗提供了有效的反向遗传操作平台。

能力验证对软件效率测试的启示

能力验证有助于检验各实验室对相应领域基本技术的掌握能力,提高相应领域检测结果的准确性和可比性,为相应领域的实验室管理和认可提供技术依据。实验室的用户、监督和管理机构、评价机构等可以利用CNAS能力验证结果,判断实验室是否具有从事检测活动的能力。本文简要介绍了CNAS组织的软件效率测试能力验证活动的情况,结合软件效率测试能力验证活动,介绍了软件效率测试的一些具体做法及几点启示。对其他软件测试实验室及软件效率测试工作具有参考价值。

职技高师教育科研管理的特点分析

职技高师教育包含工程教育、技术教育和师范教育特点,且三者间相互融合。职技高师的工程教育、技术教育与师范教育性质特点决定了其教育科研管理要体现创新性、校本性、规划性和信息化,管理者要遵循职业教育研究活动、高等教育科研活动与高等工程及技术教育科研活动的规律,为科研活动创造良好环境。

数据库设计中的规范化与派生属性处理

本文指出了参考文献［１］的错误，并且认为在关系模式中两个函数依赖的属性集合之间存在一种函数关系，含有派生属性的满足２ＮＦ的关系模式是不满足３ＮＦ的，对关系数据库模式中派生属性的处理要根据具体问题分别对待。

应用型转型背景下编辑出版学专业教师教科研能力培养及实践

高等教育顺应新时代全面进行教育教学改革,以便更好的适应应用型本科院校整体转型需求,发挥其教育教学、科学研究、人才培养、社会服务的重要职能。本文针对编辑出版专业教师教科研能力现状,阐述了应用型转型背景下,编辑出版学专业教师教科研能力培养的重要性,结合学科专业特点,提出了提高编辑出版学专业教师教学与科学研究能力的策略,提升专业教师队伍的综合能力,为地方经济发展培养更多编辑出版类应用型人才。

高校精品课程共享资源建设中存在的问题及对策研究

共享资源建设是精品课程建设的重要内容。本文针对当前精品课程共享资源建设中所存在的三大问题,提出正确界定精品课程共享资源的内涵,重视它与课程自身建设的有机结合,提倡"总体规划、分步实施"的建设原则,并给出健全动态监测机制、完善后期管理、提高服务质量等措施。

中职与应用型本科课程衔接问题探析

在中等职业教育(简称为中职)与应用型本科教育(简称为应用型本科)衔接诸多问题中,最关键、最核心的环节就是课程衔接问题。课程衔接问题的解决关乎中职与应用型本科能否顺利衔接,关乎两个不同层次的职业教育能否持续发展。本文以吉林工程技术师范学院中职与本科"3+4"衔接课程体系构建为依托,对中职与应用型本科课程衔接中存在的问题进行研究,探析问题缘由,根据职业教育发展实际,提出科学合理的优化中职与应用型本科课程衔接的思路,以期更好促进中职与应用型本科衔接工作的顺利开展。

多处理机上高次代数方程的并行求解

本文讨论在多处理机上求解n次代数方程f_n(x)=0的并行计算方法。文中给出了代数方程同时求根算法的同步并行格式和异步并行格式,还给出了两个具体的算法,它们分别是二阶收敛和三阶收敛的。在YH-2模拟器上对两个算法进行了一些数值测试,表明这两个算法对高次代数方程求根问题有较高的并行加速比。

Asia1型口蹄疫病毒感染性克隆的建立

为构建Asia1型口蹄疫病毒Asia1/YS/CHA/05株的感染性克隆,根据该毒株的全基因组序列,将其分为6段进行RT-PCR扩增,并拼接克隆至pBluescript II SK(+)载体中,构建了全长基因组的cDNA克隆pAsi。用NotⅠ将质粒线性化后体外转录并转染BHK-21细胞,转染细胞中出现明显的细胞病变。RT-PCR结合序列分析表明,拯救病毒中作为人工设计的分子标记PstⅠ酶切位点被消除,因此,排除了亲本病毒污染的可能。该感染性克隆的构建,为深入探讨Asia1型口蹄疫病毒的致病机理以及新型疫苗的研制奠定了基础。

论“网红经济”中网络编辑工作的重要性

在"互联网+"时代背景下,伴随着自媒体大热的今天,催生出了大批网络新热人物——网红,他们利用自己在一定社交领域里具有的超众粉丝数量及其影响力,结合一些投资商家,在各自领域逐渐形成独具一格的"网红经济"。这就为网络编辑工作者提出了新的工作要求,同时也为网络编辑工作提供了全新的就业模式和新的工作思维方式。传统媒体的编辑们为了更好地适应自媒体的工作环境,解决就业与择业的现实问题,被迫完成商业化转型,开辟了互联网时代新的领域。随着互联网技术的高速发展媒介融合局面的形成,网络编辑会发挥越来越重要的作用,网络编辑工作也将在"网红经济"中发挥重要作用。

建立和完善教学研究质量管理体系的探索与实践——以吉林工程技术师范学院为例

建立完善的教学研究质量管理指标体系是提升教学质量的关键。吉林工程技术师范学院从教学实际出发,研究制订了一套合理的有针对性的教学研究质量标准,构建了一个较完善的教学研究质量管理指标体系,对提高教学质量发挥了良好的作用。

地方院校教研课题质量管理体系研究

针对地方院校教学研究课题质量管理现状和问题,本文提出如何做好教学课题的质量管理,规范教研课题质量管理的各个环节,建立科学有效的管理激励机制,提高学校教研管理效率和质量,以保证教研课题的质量和数量协调发展。

加强精品课程建设提高教育教学质量

精品课程建设是高等院校教学质量与教学改革工程的重要组成部分，抓好精品课程建设，使其具有科学性、先进性、教育性、整体性、有效性和示范性，是教学改革的核心工作之一。本文就精品课程建设的实际情况，探讨了精品课程建设与教学改革的几个重要问题。

基于模型驱动架构的软件开发模式研究

基于模型驱动架构(MDA)的软件开发模式,软件开发生命周期由软件系统建模行为驱动,整个开发过程围绕模型的创建和变换开展。其中,计算无关模型(CIM)是通常意义上的“业务模型”。在分析阶段,由平台无关模型(PIM)分析员开发1个PIM。在设计阶段,由平台相关模型(PSM)创建者将PIM变换成1个或多个PSM。整个开发过程中,变换定义开发者结合具体的变换工具来开发变换定义。

O型口蹄疫病毒亚基因组复制子的构建及其鉴定

为构建含有海肾萤光素酶(Rluc)报告基因的O型口蹄疫病毒(FMDV)亚基因组复制子,本研究在前期构建的O型FMDV cDNA感染性克隆的基础上,利用融合PCR的方法,以Rluc报告基因替换FMDV的前导蛋白Lb基因和结构蛋白P1基因,构建含有Rluc报告基因的FMDV亚基因组复制子FMDVRep。将该复制子质粒线性化后,经体外转录制备复制子全长RNA,转染BHK-21细胞,通过RT-PCR方法和间接免疫荧光试验分别检测该复制子RNA的自主复制能力以及FMDV非结构蛋白3B的表达情况。结果显示,复制子RNA在BHK-21细胞中能够进行自主复制并且能够表达病毒的非结构蛋白。Rluc活性检测结果表明,该复制子RNA在BHK-21细胞中可以高效表达Rluc,在转染后2 h^12 h Rluc活性呈线性递增,进一步反映该复制子具有良好的表达外源基因的能力。O型FMDV亚基因组复制子的构建,为深入研究FMDV的复制和翻译机制奠定了基础。