M2型丙酮酸激酶对瘢痕疙瘩成纤维细胞功能的影响

目的探索M2型丙酮酸激酶(Pyruvate Kinase M2,PKM2)对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、糖酵解以及胶原合成的影响。方法应用免疫组化染色检测正常皮肤组织和瘢痕疙瘩组织中PKM2及增殖相关标记物(Ki67)的表达;应用Real-time PCR检测正常皮肤来源成纤维细胞和瘢痕疙瘩来源成纤维细胞中PKM2及纤维化指标(COL1A1、COL1A2、COL3A1)的表达;应用Western-blot检测正常皮肤来源成纤维细胞和瘢痕疙瘩来源成纤维细胞中PKM2的表达;应用Seahorse XF技术检测正常皮肤来源成纤维细胞和瘢痕疙瘩来源成纤维细胞的糖酵解功能。使用PKM2抑制剂处理瘢痕疙瘩成纤维细胞后,应用CCK-8、Ed U标记方法检测细胞增殖的变化,Seahorse XF技术检测细胞糖酵解功能的变化,Western-blot检测细胞中纤维化指标(Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原)的表达变化。结果 PKM2、增殖相关标记物(Ki67)在瘢痕疙瘩组织中的表达较正常皮肤组织中明显升高;瘢痕疙瘩成纤维细胞中的PKM2、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达水平均显著高于正常皮肤成纤维细胞;与正常皮肤成纤维细胞相比,瘢痕疙瘩成纤维细胞的糖酵解功能显著上调。PKM2抑制剂处理后,瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖能力明显受到抑制、糖酵解功能显著下调、Ⅰ型胶原纤维表达显著减少。结论瘢痕疙瘩成纤维细胞高表达PKM2,抑制PKM2可能是临床治疗瘢痕疙瘩的新途径,值得进一步深入研究。

HOXA5对病理性瘢痕成纤维细胞功能的调控机制研究

该课题旨在研究HOXA5对病理性瘢痕成纤维细胞凋亡和细胞行为的影响,以及HOXA5对细胞内p53通路活化的调控作用。取患者增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织,分离培养成纤维细胞。将HOXA5过表达质粒转染细胞,通过CCK-8检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡情况, Transwell检测细胞迁移能力, Western blot检测细胞内α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、黏着斑蛋白(vinculin)以及I、III型前胶原肽的蛋白含量,并构建含成纤维细胞的胶原网架(FPCL)评价细胞收缩能力。进一步通过p53启动子荧光素酶报告基因检测HOXA5对p53通路的激活作用, ChIP PCR检测HOXA5与p53启动子区含ATTA的HOX核心结合序列的结合情况。Western blot检测p53下游靶点p21和MDm2蛋白含量。结果显示,转染了HOXA5过表达质粒的细胞增殖活性下降,迁移、收缩能力减弱,细胞凋亡情况加重,细胞内α-SMA、vinculin以及I、III型前胶原肽的蛋白含量减少。细胞内进一步的机制研究发现, HOXA5过表达可以促进p53启动子荧光素酶报告基因的表达, ChIP PCR检测发现,过表达HOXA5后, p53启动子区富含ATTA的HOX核心结合序列区域结合的HOXA5增多,并且p53下游靶点p21和MDm2蛋白含量显著增加。综上,该实验证实了HOXA5可以激活病理性瘢痕成纤维细胞内p53凋亡通路,并促进细胞凋亡,抑制细胞的增殖、迁移和收缩能力。