A型肉毒神经毒素基因的PCR检测

目的:建立快速筛查A型肉毒毒素的PCR方法。方法:根据GenBank中报道的肉毒毒素基因序列,综合应用多种生物软件分析设计特异的检测引物,从提取的基因组DNA、热裂解产物和菌液等不同形式的模板中扩增大小为457bp的A型肉毒毒素特异基因片段,以肉毒梭菌其他血清型及破伤风梭菌为对照。结果:检测方法无交叉反应,灵敏度可达10pgDNA,3×103个菌。结论:建立的检测方法特异性强、灵敏度高,可以用于A型肉毒毒素基因的快速筛查。

副溶血弧菌毒力因子及致病机理的研究进展

副溶血弧菌为一种嗜盐性革兰氏阴性短杆菌,是引发人食源性疾病的主要致病菌之一,主要分布在海洋环境中。副溶血弧菌的毒力因子主要包括黏附因子、侵袭因子、溶血性毒素、尿素酶、脂多糖、外膜蛋白、蛋白酶、Ⅲ型分泌系统和摄铁系统等。本文就副溶血弧菌的主要毒力因子及其致病机理的研究进展进行综述,可为进一步研究该菌的分子致病机理、制定快速精确的检测方法等提供参考。

CTMAB改性膨润土对活性艳蓝的吸附性能

采用碳酸钠-十六烷基三甲基溴化铵（CTMAB）复合法对天然膨润土进行改性,并通过红外光谱和X射线衍射分析手段对所制备的CTMAB改性膨润土进行了结构表征。以CTMAB改性膨润土为吸附剂对模拟活性艳蓝染料废水进行吸附脱色试验,结果表明：改性膨润土的脱色效果大大优于原土。在废水活性艳蓝浓度为50mg/L,pH=7,改性膨润土用量为5.0 g/L,吸附时间为50 min的条件下,模拟废水的脱色率达91.98%。

腐植酸液体叶面肥对保护地菜豆产量与品质的影响

采用大棚小区随机区组设计,研究了不同浓度腐植酸液体叶面肥对"将军一点红"、"紫花油豆"产量和品质的影响,以期为菜豆合理使用腐植酸液体叶面肥提供科学依据。结果表明:腐植酸液体叶面肥最佳喷施浓度为600倍时菜豆产量较对照显著增加,"紫花油豆"增加11.6%,"将军一点红"增加9.8%;腐植酸液体叶面肥可显著改善菜豆品质,其中可溶性糖、维生素C及粗蛋白含量增加显著,硝酸盐含量较CK相比"紫花油豆"降低了26.3%,"将军一点红"降低了25.6%。

利用噬菌体随机肽库筛选可结合志贺毒素B亚单位的短肽序列

以制备的重组志贺毒素B亚单位(StxB)为靶标,利用噬菌体展示亲和淘选技术,经4轮筛选,从随机十二肽库中筛选到与StxB结合的一批噬菌体克隆,对特异结合活性较高的27个噬菌体克隆的表面展示肽进行序列测定,其中A6序列出现16次,A9和A3序列分别出现2次和3次。为评价筛选克隆中和毒素毒性的能力,将展示肽出现频率最高的A6噬菌体克隆,体外与志贺毒素孵育进行动物试验,动物存活率达33.3%,表明毒素的毒性得到部分抑制,A6短肽可能发展成为志贺毒素的拮抗剂。

小儿哮喘的整体护理探析

目的对整体护理应用于小儿哮喘中的效果进行分析探讨。方法选取2013年12月-2015年8月我院收治的小儿哮喘61例,将患儿随机分为常规护理组（28例）和整体护理组（33例）,观察两组患者的护理措施的效果并进行比较。结果整体护理组的治疗依从率和护理满意度分别为90.9%和93.9%,高于常规护理组的71.4%和78.6%;同时整体护理组每天哮喘发作次数少于常规护理组,呼气峰流速值高于常规护理组,P〈0.05,差异具有统计学意义。结论整体护理应用于小儿哮喘中的效果确切,能够使患儿治疗依从性提高,对提高生活质量和预后效果具有重要作用。

细节管理在小儿腹泻护理中的运用

目的探究小儿腹泻患者采取细节护理的措施和效果。方法选取2014年8月~2015年10月收治81例小儿腹泻患者进行护理研究,随机分组,实验组44例患者采取细节护理,对照组37例患者采取常规护理,比较两组患者的护理效果。结果实验组护理的总有效率为93.18%,对照组护理的总有效率为83.78%。实验组患者的护理效果高于对照组,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论小儿腹泻患者采取细节护理,可促使身体症状的改善,提高治疗效果,在临床护理中可广泛应用。

腐植酸液体叶面肥对大白菜产量与品质的影响

为了合理使用腐植酸液体叶面肥,以提高大白菜产量,采用随机区组法,研究了不同浓度腐植酸液体叶面肥对大白菜产量和品质的影响。结果表明:腐植酸液体叶面肥最佳喷施浓度为600倍液,此时大白菜产量较对照显著增加,达到95 640kg.hm-2,比对照增产11.45%,并显著改善了白菜品质,可溶性糖、可溶性蛋白及VC含量增加显著,并能显著降低硝酸盐含量。

鼠疫耶尔森菌毒力蛋白YopE的新功能

鼠疫耶尔森菌外部蛋白E(YopE)是鼠疫耶尔森菌的6种分泌蛋白之一,主要通过其144位的"精氨酸手指"结构与细胞膜耦联蛋白RhoGTP酶相互作用发挥功能.本文构建YopE及其144位突变体YopE(R144A)的可诱导表达系统,并优化了诱导条件.用该系统结合流式细胞技术检测YopE和YopE(R144A)对细胞凋亡、细胞周期和细胞活性氧(ROS)水平的影响.结果显示:YopE(R144A)促进HeLa细胞凋亡;使G0/G1期细胞比例上升,G2/M期细胞比例下降;随着YopE(R144A)表达量增加,p21蛋白的表达量也增加;YopE(R144A)也能抑制细胞ROS的产生.研究结果提示,YopE在细胞内可能存在新的致病靶点.

布鲁菌液体气溶胶肺部感染途径小鼠模型建立及毒理评价

目的建立布鲁菌液体气溶胶感染小鼠模型并进行毒理评价。方法选取6~8周龄BALB/c雌鼠,经肺递送和滴鼻2种途径感染布鲁菌S19-CN,分别于第0、2、4、6、8周,观察并记录临床体征,采集样本,分别对脾脏和肺脏载菌量计数及抗体(血清)和细胞因子(血清和肺匀浆)进行检测。结果与空白对照组比较,感染后,肺递送组、滴鼻组小鼠均未见病症;体质量无显著下降;脾重分别在感染后第2周、第4周达到峰值;肺载菌量均在第2周达到峰值,约107 CFU/g;血清抗体均在感染后8周内维持较高水平,肺递送组和滴鼻组的血清和肺匀浆中均可检测到高浓度细胞因子IFN-γ、TNF-α,且肺递送组峰值高于滴鼻组,与空白对照比较差异有统计学意义(P均<0.05)。结论本研究通过布鲁菌S19-CN液体气溶胶肺递送感染BALB/c小鼠,成功建立布鲁菌液体气溶胶感染小鼠模型。S19-CN引起BALB/c小鼠慢性感染,脾肿大明显,毒理作用显著;同时激发了较强的细胞免疫和体液免疫反应。

针对性护理干预对小儿过敏性紫癜临床疗效和护理满意度的影响分析

目的探讨针对性护理干预对小儿过敏性紫癜临床疗效和护理满意度的影响。方法选取本院2017年1月~2018年12月收治的136例过敏性紫癜患儿作为研究对象,采用数字表法将其分为对照组和观察组,每组各68例。对照组患者采用常规的护理干预,观察组患者在对照组基础上采用针对性护理干预。护理结束后比较两组患者的临床效果及护理满意度。结果观察组患者腹痛缓解时间、皮疹消退时间、住院时间经明显短于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);观察组患者护理满意度为(98.56±4.10)分,明显高于对照组(85.26±12.63)分,差异有统计学意义(P<0.001)。结论针对性护理干预可有效缩短小儿过敏性紫癜患者腹痛缓解、皮疹消退及住院时间,患者护理满意度高。

铜绿假单胞菌成孔毒素ExlA编码基因无痕缺失突变株的构建及其基本特性研究

目的构建铜绿假单胞菌NY8755 exlA基因无痕缺失突变株(NY8755ΔexlA),研究成孔毒素ExlA的基本特性。方法利用二次同源重组的方法构建铜绿假单胞菌exlA基因无痕缺失突变株。选取6~8周龄雌性C57BL/6J小鼠,经气溶胶肺递送途径分别感染铜绿假单胞菌NY8755和NY8755ΔexlA,记录感染后7 d小鼠的生存状况和体重变化,检测小鼠肺泡灌洗液中的促炎因子。结果经过测序验证,成功构建铜绿假单胞菌成孔毒素ExlA编码基因无痕缺失突变株。利用气溶胶肺递送途径感染小鼠(1×107 CFU)后,野生株组小鼠48 h内全部死亡,突变株组48 h后开始死亡且7 d后仍有40%存活;突变株组存活小鼠体重先下降,后逐渐恢复;感染12 h后野生株组小鼠肺泡灌洗液明显比突变株组血性渗出物更多(颜色更红),肺泡灌洗液中促炎因子白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-17A(IL-17A)含量有显著差异。结论铜绿假单胞菌成孔毒素ExlA是exlA阳性的新型铜绿假单胞菌的关键毒力因子,可显著影响小鼠的生存状况,引起小鼠体内明显的炎症反应。当前关于外毒素ExlA的致病机制研究较少,所构建的NY8755ΔexlA突变株及野生株和突变株肺炎小鼠模型,可为进一步探索exlA阳性的铜绿假单胞菌致病机制提供研究基础。

梭菌属神经毒素的基因鉴定与分型

目的：建立梭菌属神经毒素基因快速鉴定和分型的PCR方法。方法：根据GenBank提供的肉毒毒素及破伤风毒素基因序列，综合应用多种生物学软件与在线分析平台，设计特异性及通用检测引物，对各型梭菌属毒素基因进行PCR扩增，验证扩增反应的特异性、通用性、灵敏度及重复性。结果与结论：设计了针对A，B，E，F型肉毒毒素、破伤风毒素基因轻链毒性活性区的5对特异引物，以及重链跨膜区和结合区的一对通用引物（BonAB—P01／P02，BonB-P01／P02，BonE-P01／P02，BonF-P01／P02，TET-P01／P02，TY-P01／P02）。对各型神经毒素进行特异性扩增并在型间进行交叉实验，检测特异性良好，没有交叉反应；通用扩增结果显示均得到1100bp大小的条带。目前此检测方法灵敏度可达到（1～3）×10^3个菌。该检测方法特异性强，灵敏度高，可以用于梭菌属神经毒素基因的快速筛查与鉴定分型。

产IMP酶4种病原细菌的检测及其耐药性

采用16SrRNA和种特异基因的聚合酶链反应(polymerase chainreaction,PCR)鉴定菌株;用VITEK-AMS 60全自动微生物分析仪测定最小抑菌浓度(minimum inhibition concentration,MIC);PCR测序检测已知的超广谱β-内酰胺酶基因(extended spectrum beta-lactamases,ESBLs)和碳青霉烯酶基因;改良型Carba NP法检测碳青霉烯酶类型。对来自4家医院的6株高水平耐碳青霉烯类抗生素临床分离菌株的检测和耐药性研究。结果显示,6株分别为阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌、产酸克雷伯菌各1株,肺炎克雷伯菌3株,且均为blaIMP扩增阳性,并携带1个或多个blaTEM、blaCTX-M-1group、blaSHV、blaVIM、blaOXA-1基因。6株菌均产B型碳青霉烯酶,且对头孢菌素类和碳青霉烯类抗菌药物高水平耐药。结果表明,6株菌对头孢菌素类和碳青霉烯类抗菌药物多重耐药的主要决定因子是产B型碳青霉烯酶IMP,且和携带ESBLs基因也相关。

拟核结合蛋白H-NS调控副溶血弧菌vp1667的转录

目的研究副溶血弧菌H-NS对vp1667的转录调控机制。方法提取副溶血弧菌hns突变株(Δhns)和野生株(WT)的总RNA,采用实时定量RT-PCR的方法验证H-NS对vp1667的转录调控关系;采用引物延伸实验研究vp1667的转录起始位点,并根据产物的丰度判断H-NS对vp1667的调控关系;将vp1667的启动子区克隆入p HRP309质粒的β-半乳糖苷酶基因上游,构建Lac Z重组质粒,并将该重组质粒转入Δhns和WT中获得Lac Z菌株。通过Lac Z报告基因融合实验研究H-NS对vp1667的调控关系。PCR扩增vp1667的启动子区序列并纯化His-H-NS蛋白,通过凝胶阻滞实验(EMSA)研究His-H-NS对vp1667启动子区是否具有直接的结合作用;采用DNaseⅠ足迹实验研究HisH-NS对vp1667启动子区的具体结合位点。结果与结论引物延伸结果显示,vp1667只有一个转录起始位点T(-28)(翻译起始位点为+1),且其转录活性受H-NS的抑制;EMSA和DNaseⅠ足迹实验结果显示,His-H-NS不能结合到vp1667的启动子区,表明H-NS只能间接抑制vp1667的转录。

鼠疫耶尔森菌Ⅲ型分泌系统相关基因的功能研究

目的研究鼠疫耶尔森菌pCD1质粒上编码的假定蛋白YpCD1．08、YpCD1．09、YpCD1．16与pCD1质粒编码的Ⅲ型分泌系统（T3SS）在功能上的相关性。方法采用λ-Red重组系统构建鼠疫耶尔森菌YpCD1．08、YpCD1．09、YpCD1．16基因的突变株，通过测定分别培养于26℃下有钙、37℃下无钙和有钙TMH培养基中的以上3种突变菌株及野生菌株的生长曲线，分析突变菌株的低钙响应情况；在26℃和37℃条件下分别培养鼠疫菌突变菌株，并提取总RNA，采用定量PCR分析3种基因的转录水平及其对温度的依赖性；用β-内酰胺酶报告分子的方法分析3种基因的突变对效应蛋白转运的影响。结果在26℃和37℃低钙培养条件下，突变菌株△YpCD1．08、AYpCD1．09、△YpCD1．16的生长曲线与野生型菌株一致，表明其低钙响应正常。YpCD1．08、YpCD1．09、YpCD1．16基因在37℃与26℃转录水平的比值分别为2．3±0．3、2．3±0．5、3．2±0．7，表明这3个基因在鼠疫菌中均有转录，且其转录水平受温度调控，与T3SS基因转录水平的温度依赖性一致。β-内酰胺酶报告分子实验结果表明，突变菌株△YpCD1．08在140min时477与520nm波长的发光强度的比值为2．5，而野生型菌株仅为1．8，表明△YpCD1．08菌株对YopE的转运能力要高于野生株，而其他两个突变株与野生株类似。结论YpCD1．08、YpCD1．09、YpCD1．16基因有可能是T3SS的新成员，假定蛋白YpCDI．08可能参与效应蛋白YopE的转运及其调控。

不同培养条件下鼠疫菌PhoP/PhoQ的自调控模式研究

目的研究鼠疫耶尔森菌PhoP/PhoQ在不同培养条件下的自调控关系。方法 PCR扩增YPO1635启动子区DNA序列,并克隆入pRW50质粒β-半乳糖苷酶基因的上游,构建LacZ重组质粒,进而将该重组质粒转入鼠疫菌野生株(WT)和phoP突变株(ΔphoP)中,通过测定二者中β-半乳糖苷酶活性差异来判定PhoP对YPO1635的调控关系。提取WT和ΔphoP的总RNA,采用引物延伸实验研究phoP的转录起始位点,并根据产物的丰度判断PhoP对phoP的调控关系。结果 LacZ结果表明,在低Mg^(2+)TMH和BHI培养基中,PhoP能激活YPO1635的转录,而在高Mg^(2+)TMH中,PhoP对YPO1635的转录无调控作用。引物延伸结果显示,phoP有两个转录起始位点G(-90)和A(-118)(分别记为P1和P2,翻译起始位点为+1),在低Mg^(2+)TMH中,PhoP能激活P1的转录,而对P2无调控作用;在高Mg^(2+)TMH中,PhoP对二者均无调控作用;在BHI中,PhoP对二者的转录均具抑制作用。结论PhoP/PhoQ的自调控关系随周围环境的变化而表现出不同的模式,这有利于鼠疫菌快速适应外界生存环境的改变。

产碳青霉烯酶KPC-2的肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌的分离与耐药性研究

目的研究临床分离的1株肺炎克雷伯菌(KPN)和1株铜绿假单胞菌(PAE)对碳青霉烯类抗生素的耐药机制。方法利用种属特异基因PCR扩增、MALDI-TOF质谱技术及细菌16S r DNA测序鉴定细菌种属;采用VITEK 2 Compact系统检测细菌对各类抗生素的最低抑菌浓度(MIC);应用改良型Carba NP法、质粒抽提、电转化实验、耐药基因PCR扩增及测序,分析细菌编码的β-内酰胺酶基因。结果临床分离的1株KPN和1株PAE及其相应的转化子均产A类酶,PCR扩增测序显示PAE含有blaKPC-2型碳青霉烯酶编码基因,KPN含有blaKPC-2型碳青霉烯酶编码基因和blaSHV型超广谱β-内酰胺酶编码基因。二者的转化子只有blaKPC-2编码基因。结论临床分离的耐碳青霉烯类抗生素的KPN和PAE均携带A类2f组型碳青霉烯酶blaKPC-2编码基因且位于质粒上,而KPN所含的超广谱β-内酰胺酶blaSHV编码基因可能位于不同质粒上,或存在于该菌的染色体上。

鼠疫耶尔森菌Ⅲ型分泌系统相关蛋白β-内酰胺酶报告系统的建立

目的构建鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)Ⅲ型分泌系统(T3SS)相关蛋白β-内酰胺酶(TEM-1β-lactamases,Bla)报告基因载体,旨在运用本系统检测鼠疫菌待测蛋白能否转运至宿主细胞内。方法将TEM基因克隆入pA-CYC184载体中,构建用于鼠疫菌研究的TEM报告基因载体。把待分析的鼠疫菌基因及启动子区克隆入TEM基因上游,使鼠疫菌蛋白与TEM蛋白融合表达。将鼠疫菌基因-TEM融合表达载体电转化到鼠疫菌中,并感染HeLa细胞2 h后,加入CCF2-AM底物,在激光共聚焦显微镜下观察结果。结果与结论应用本系统检测了YopK-Bla、YscK-Bla、YscL-Bla和YscX-Bla进入宿主细胞的情况,YopK-Bla和YscX-Bla菌株感染的HeLa细胞呈蓝色,YscK-Bla和YscL-Bla菌株感染的HeLa细胞呈绿色,表明YopK及YscX可以进入宿主细胞,而YscK和YscL则不能。本研究成功地构建了适于鼠疫菌的TEM报告基因系统,该系统可作为分析其他鼠疫菌蛋白能否在感染的过程中进入宿主细胞的工具,为鼠疫菌T3SS相关蛋白致病机制研究奠定了基础。

循证护理联合临床护理路径在儿童糖尿病中的应用效果

取2015年1月到2017年1月间60例儿童糖尿病患儿,随机平分为基础组进行常规护理,联合组实施循证护理联合临床护理。结果:联合组血糖控制总有效率、家长护理满意度评分及疾病知识知晓度评分均高于基础组,不良事件发生率低于与基础组,P<0.05。结论:运用循证护理联合临床护理路径的应用效果显著。