抗氧化酶交联的多聚血红蛋白的制备及其自氧化稳定性研究

目的制备具有抗氧化保护功能的多聚血红蛋白作为红细胞代用品,并对其自氧化稳定性和部分生物学特性进行研究。方法采用戊二醛交联法制备抗氧化酶交联的多聚血红蛋白;Drabkins法测定不同温度、时间保存下制品MetHb(%)的变化;流式细胞术检测制品与中性粒细胞孵育后细胞吞噬功能的变化以及制品对T细胞和血小板的活化作用;凝集试验检测血浆中凝血因子活性;Western blot法检测制品输注后在小鼠体内的清除速率;ELISA法检测制品在小鼠体内的抗原性。结果制备的抗氧化酶交联的多聚血红蛋白溶液Hb浓度70g/L,MetHb(%)6.61±1.42,粒径28nm;制品在4℃、24℃不同保存时间均呈自氧化稳定,37℃、8h显示抗氧化酶交联的多聚血红蛋白较多聚血红蛋白有更强的自氧化稳定性;制品与中性粒细胞孵育后并未影响其吞噬功能,对T细胞和血小板无活化作用;对凝血因子活性也无明显影响;制品输注后48h仍有检出;抗氧化酶交联的多聚血红蛋白PolyHb-SOD-CAT抗原性较弱。结论抗氧化酶交联的多聚血红蛋白是一种潜在的安全有效的红细胞代用品,并具有较强的抗氧化稳定性。

烟碱对胶原诱导关节炎小鼠调节作用及乙酰胆碱受体对体外诱导Th17细胞分化和功能影响的初步研究

目的探索烟碱刺激对胶原诱导关节炎小鼠病症,特别是对小鼠Th17细胞含量变化的影响。以及活化的乙酰胆碱受体对体外诱导培养Th17细胞分化和功能的影响。方法胶原诱导关节炎小鼠被随机分为对照组和烟碱实验组,自d21至d28,分别喂饲PBS溶液和烟碱PBS溶液(2mg/kg)。采用流式细胞术和PCR方法分别检测两组小鼠的脾脏CD4+细胞表型和炎症因子mRNA表达变化。小鼠血浆细胞因子TNF-α采用CBA方法检测。烟碱乙酰胆碱受体α7亚基的检测分别采用流式、Western Blot和PCR方法。随后,采用烟碱刺激体外诱导纯化的Th17细胞,

不同方法测定血红蛋白溶液中总蛋白量的比较

目的 采用三种方法对含有大量血红蛋白溶液的样本测定总蛋白量,并进行比较,确定一种可行且简单的测定血红蛋白溶液中总蛋白量的方法。方法 分别采用BCA法、Bradford法和Lowry法测定溶液总蛋白量,并采用HiCN法测定溶液中血红蛋白的含量。比较不同方法测得数据的差异。结果 5份样本用BCA法测得总蛋白量为76 .33g/L ,Bradford法测得值为179.5 9g/L ,Lowry法测得值为2 2 .81g/L。HiCN法测定血红蛋白量为133.6 5g/L。结论 Bradford法是一种可行且重复性好的测定血红蛋白溶液中总蛋白量的方法,BCA法和Lowry法的测定结果明显低于实际值。

雷帕霉素联合人脐带血CD4^+ CD25^+调节性T细胞治疗胶原诱导性关节炎小鼠的初步研究

目的:初步探讨雷帕霉素(Rapa)联合人脐带血CD4+CD25+调节性T细胞(Tregs)对胶原诱导性关节炎小鼠的治疗作用。方法:通过体外扩增培养获得人脐带血Tregs;建立牛Ⅱ型胶原诱导的类风湿性关节炎(CIA)小鼠模型;将CIA小鼠随机分为对照组,Tregs治疗组,Rapa治疗组,Tregs与Rapa联合治疗组;小鼠骨关节切片进行Safranin O-fast green染色、甲苯胺蓝染色以及HE染色;ELISA法检测CIA小鼠血浆抗Ⅱ型胶原抗体浓度;流式细胞术检测CIA小鼠脾脏CD4+T细胞亚型;检测Tregs在体外对CIA小鼠Ⅱ型胶原特异性CD4+T细胞增殖的抑制功能;Transwell分隔培养法比较非接触培养与直接接触培养中Tregs对CD4+T细胞增殖抑制作用的差异。结果:Tregs与Rapa联合治疗能够延缓疾病发生,显著降低关节炎评分,减少CIA小鼠关节中软骨的破坏以及炎症细胞浸润,降低CIA小鼠血浆中抗胶原总IgG抗体水平以及脾脏中Th17细胞比例;Tregs在体外能够有效抑制CIA小鼠胶原特异性CD4+T细胞的增殖,这种抑制作用主要可能是通过直接接触抑制途径起作用。结论:雷帕霉素联合人脐带血Tregs治疗能够改善CIA小鼠关节炎症状。

脐血与外周血NKT细胞的体外扩增及其表型比较

为了建立体外有效扩增脐血与外周血天然杀伤T细胞(NKT细胞)的方法并研究其表型的差异,分别采用单加IL-2及同时加IL-2和α-半乳糖神经酰胺(α-Galcer)的方法,从人脐血单个核细胞(UCB-MNC)和人外周血单个核细胞(PB-MNC)中扩增NKT细胞;用流式细胞检测技术测定NKT细胞(TCR Vα24+TCR Vβ11+)的比例及其它表型特征。结果显示:UCB-MNC在第7天时,其TCR Vαβ+NKT细胞的扩增量占淋巴细胞的(24.48±4·19)%,是原来的(8.74±4.37)×102倍(P<0.01),而且大多不表达NK1.1(CD161);TCR Vβ11+较TCRVα24+高表达;第14天时,PB-MNC中的TCR Vαβ+NKT细胞扩增量占淋巴细胞的(11.1±3.61)%,是原来的(3·72±2·01)×102倍(P<0.01),且NK1.1高表达,TCR Vβ11+与TCR Vα24+表达率基本一致。结论:α-Galcer对NKT细胞有特异的扩增功能,且脐血NKT的扩增效率较外周血高。以表型划分,脐血中的NKT细胞多为NK1.1-,而外周血多为NK1.1+,是一种新的NKT细胞亚型。

耐受型DC/TGF-β联合诱导的iTreg细胞能有效抑制自身免疫性关节炎

目的初步探讨通过成熟耐受型DC(mtDC)与转化生长因子-β(TGF-β)联合诱导的诱导型调节性T细胞(i Treg细胞)对自身免疫性关节炎的抑制作用。方法在体外,对CD4+CD25-T细胞进行TGF-β诱导和mtDC细胞扩增,获得iTreg_(mtDC)细胞。通过流式细胞术、细胞计数、CBA等方法检测iTreg_(mtDC)细胞的表型、对CD4+T效应细胞增殖的抑制作用。在体内实验中,iTreg_(mtDC)细胞以1×10~6个细胞/ml的剂量过继性输注入胶原诱导性关节炎(CIA)小鼠体内,并通过关节病变评分、病理组织病变评分、血清中细胞因子、总anti-CⅡIgG的分泌情况来评价iTreg_(mtDC)细胞对CIA的抑制作用。结果在体外,通过TGF-β和mtDC细胞两轮诱导/扩增后,Treg_(mtDC)细胞得以大量扩增,并能持续表达高水平的Foxp3。在体外,与iTreg细胞相比,Tregmt DC细胞有更强的抑制效应T细胞增殖的能力。在体内,与iTreg细胞相比,Treg_(mtDC)细胞的过继性输注能更有效地减少发病关节处的炎性浸润,进一步改善CIA的症状;对CIA小鼠体内细胞因子的分泌有更强的调节能力,能更显著地减少炎性因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-17(IL-17)的分泌,并促进大量TGF-β产生;更明显地降低总anti-CⅡIgG的分泌量;进而更有效地抑制CIA病程的发展。结论与iTreg相比,iTreg_(mtDC)细胞能通过调节体内细胞因子和抗CⅡIgG的分泌更有效地抑制CIA病程发展。

不同来源的树突状细胞对扩增脐血NKT的影响

目的比较不同来源的DC对扩增脐血NKT的影响。方法分别以外周血和脐血为来源诱生DC,在-αGalcer和IL-2的联合刺激下,对脐血中的NKT进行扩增。用流式细胞检测技术分析不同来源DC的表型区别,并对它们扩增的NKT细胞(TCR Vα24+TCR Vβ11+)进行鉴定。结果在14 d的培养时间里,由PB-DC参与的TCR Vαβ+NKT细胞的扩增量占淋巴细胞的(20.8±5.25)%,是原来的(8.22±2.75)×102倍;而由CB-DC参与的TCR Vαβ+NKT为(11.26±5.63)%,是原来的(4.66±2.12)×102倍;未加DC组,单用-αGalcer和IL-2,NKT的最终扩增量也达到了(10.84±4.00)%。3组较原来都呈现显著性扩增(P<0.01),其中以PB-DC参与的NKT扩增组效率最高(P<0.001)。经流式检测,PB来源的DC,其表面CD1d表达明显高于CB来源的DC(P<0.001),而共刺激分子则较脐血DC低。结论-αGalcer对NKT细胞有特异地扩增功能;NKT的扩增效率与DC细胞之间有着密切的关联,以外周血为来源的DC,其协同刺激脐带血NKT的扩增功能较脐血DC强。

库存血小板血浆中sCD40L含量变化及其对PMNs呼吸爆发的作用

目的探讨单采血小板(A-PLTs)和白膜法浓缩血小板(BC-PLTs)库存过程中,其乏血小板血浆(简称血浆)中可溶性CD40配体(sCD40L)含量变化及对中性粒细胞(PMNs)呼吸爆发的作用。方法取库存d1、d3、d5的A-PLTs和BC-PLTs,离心分离获得血浆;ELISA检测血浆中sCD40L的含量;用活性氧特异性荧光探针二氢若丹明123(DHR),流式细胞术检测PMNs呼吸爆发;以小鼠抗人CD154抗体抑制试验去除sCD40L。结果 sCD40L含量(pg/mL),在血小板库存d1、d3、d5时,A-PLTs血浆分别为1 341.62±279.92、2 589.69±856.83及3 250±1 170.44(P<0.05);BC-PLTs血浆分别为3 342.35±1 322.30、3 827.12±1 714.43及3 691.87±1 631.03(P>0.05)。血浆引发fMLP(formyl-Met-Leu-Phe)活化的PMNs呼吸爆发程度(PMNs的引发活性),库存d1、d5 A-PLTs血浆处理组相对于单独加入fMLP阴性对照组其MFI比值相应为1.25±0.1、1.76±0.41(P<0.05)。用小鼠抗人CD154抗体特异性去除血浆中的sCD40L后血浆引发fMLP活化的PMNs呼吸爆发程度相应降低41.84%。以0.1μm滤器滤除血小板微粒后血浆引发fMLP活化的PMNs呼吸爆发程度相应降低69.56%。结论常规库存的血小板随库存时间延长,其血浆中的sCD40L水平升高,并对fMLP活化的PMNs的呼吸爆发具有引发作用。

S1P/S1PR信号通路对中性粒细胞功能的影响

本研究旨在检测1-磷酸鞘氨醇(S1P)对fMLP活化的中性粒细胞的引发作用,检测粒细胞活化后发生呼吸爆发的产物,并探究S1P引发作用的信号通路。流式细胞术检测新鲜分离的中性粒细胞的状态;高铁细胞色素C还原法间接计算超氧阴离子(O2-)释放量;二氢罗丹明123流式细胞术检测粒细胞的呼吸爆发程度;免疫印迹法检测PI3K-Akt信号通路相关蛋白的表达。结果表明,S1P预处理后fMLP活化的粒细胞所释放的O2-量明显增高;S1P引发的fMLP活化组中,罗丹明123的平均荧光强度明显高于fMLP单独处理组;PI3K及Akt蛋白参与了粒细胞呼吸爆发的信号传递。结论:S1P是一种新的粒细胞引发试剂,较高浓度S1P(10-6μmol/L)能够引发fMLP活化的中性粒细胞发生呼吸爆发;该信号通路可能为S1P与粒细胞上的S1P受体作用,活化下游的PI3K,再通过Akt传递信号,最终活化NADPH氧化酶,发生呼吸爆发。

同种异基因耐受型树突状细胞能有效的抑制自身免疫性关节炎的发生

目的初探同种异基因tDCs(allogeneic tolerogenic dendritic cells,allo-tDCs)对自身免疫性关节炎发生和发展的抑制作用。方法在体外,B6小鼠(H-2Kb)的骨髓细胞经低剂量GM-CSF、IL-10和TGF-β诱导10d后产生tDCs,并检测其表型、细胞因子分泌情况及体外抑制功能。建立胶原诱导型(collagen-induced arthritis,CIA)小鼠模型。在d0和d21对D1小鼠(H-2Kq)进行2次牛Ⅱ型胶原(bovine typeⅡcollagen,CII)免疫,d28开始发病,即为CIA小鼠模型。在d28,过继性输注不同剂量(5×104/只,5×105/只,5×106/只)的allo-tDCs或负载CII的allo-tDCs(即CII-tDCs)。

鞘氨醇-1-磷酸对人耐受型树突状细胞功能影响的初步研究

目的探讨鞘氨醇-1-磷酸(S1P)对外周血单核细胞诱生的人耐受型树突状细胞(tDC)免疫学功能的调控作用。方法 RT-PCR和流式检测细胞表型以及S1P受体(S1PR s)的表达;加入S1P处理tDC,检测其对tDC表型、细胞因子表达以及信号蛋白细胞外调节蛋白激酶(ERK)磷酸化的影响。结果 tDC高表达DC标志CD209、共刺激分子CD80、CD86和成熟标志CD83;炎性细胞因子mRNA的表达低于未成熟DC,而抑炎性细胞因子、Fas-L和IDOmRNA的表达均高于iDC;tDC表达S1P的受体,S1P与受体相互作用后可引起信号蛋白ERK的磷酸化,上调tDC抑炎性细胞因子以及Fas-L mRNA的表达,对炎性细胞因子的表达无影响。结论 tDC表达S1P受体1、2、5,S1P信号活化后可上调抑炎性细胞因子mRNA的表达,而其表型和炎性细胞因子的分泌无明显变化,有利于tDC免疫耐受功能的发挥。

调节性DC分泌exosomes对急性GVHD抑制作用的初步研究

目的探讨调节性树突状细胞(rDC)分泌exosomes在移植物抗宿主病(GVHD)模型中的免疫抑制作用。方法用TGF-β1和IL-10诱导从C57BL/6小鼠骨髓来源产生rDC,负载DBA/2小鼠来源的抗原,应用流式检测rDC表型。采用超速离心结合膜超滤的方法分离纯化rDC分泌的exosomes,电镜检测exosomes形态。在以DBA/2小鼠为受鼠,C57BL/6小鼠为供鼠的急性GVHD模型中,尾静脉注射rDC分泌的exosomes,观察受鼠急性GVHD症状的改变。结果rDC的I-A/I-E(MHC-类分子),共刺激分子CD80、CD86表达量均比未成熟树突状细胞(imDC)低,其分泌的exosomes为直径小于100nm的小囊泡。在小鼠急性GVHD模型中,同种异基因骨髓移植0、7、14d静脉注射rDex(15μg/只)治疗的小鼠,GVHD表现较对照组症状轻,生存期较长,两组相比差异有统计学意义(P<0.05);且较静脉注射rDex30μg/只的治疗效果好。结论rDC分泌的exosomes能够提高GVHD小鼠生存率,可应用于治疗急性GVHD。

体外诱导扩增的CD1d限制性人外周血NKT细胞克隆过早凋亡的机理研究

目的针对NKT细胞培养扩增和培养过程中遇到的过早凋亡现象,在凋亡信号层面进行初步的描述和探讨。为今后的NKT相关研发提供数据参考。方法自健康人浓缩白细胞制品(白膜)分离有外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells PBMNCs),利用其中的抗原递呈细胞,以α-Gal Cer的刺激NKT细胞克隆产生,记录3-4周NKT的表型变化,和Caspase-3酶活化及细胞凋亡状况。结果刺激7 d后,NKT克隆开始产生,持续扩增3周左右后开始呈现凋亡状态,Caspase3酶在第2周即开始维持高活性状态。人NKT细胞对α-Gal Cer的刺激的反应具有很大的个体差异。结论 NKT细胞克隆可以再最初的3周内如同常规T细胞克隆一样生长,其后则会因α-GalCer刺激引发活化后凋亡。

雷帕霉素处理后的树突状细胞对感染后输血相关急性肺损伤保护作用

目的 探讨雷帕霉素处理后的树突状细胞(dendritic cells, DC)干预感染后输血相关急性肺损伤(transfusion-related acute lung injury, TRALI)策略的可行性。方法 1)通过细菌脂多糖(LPS)联合抗-H2Kd诱导小鼠TRALI的发病,并测定小鼠肺脏,肾脏,脾脏和脑组织等器官湿干比及肛温,建立TRALI小鼠模型;2)体外诱导小鼠骨髓来源的DC细胞,并经雷帕霉素(10nM)处理24 h;3)小鼠经尾静脉注射或不注射雷帕霉素或雷帕霉素处理后的DC,1 h后腹腔注射LPS,24 h后注射抗-H2Kd诱导TRALI发病,观察并记录小鼠死亡情况,并通过小鼠体温、肺脏湿干比、胸腔积液重量以及肺组织病理切片分析小鼠TRALI发病后情况。结果 通过对不同浓度和不同容量的抗-H2Kd溶液诱导效果的比较,本研究选择0.1 mg/kg LPS联合4.5 mg/kg抗-H2Kd(输注体积100μL)诱导的小鼠模型为TRALI小鼠模型。该模型小鼠TRALI发病后,能显著增加了肺脏湿干比,体温显著降低。使用雷帕霉素处理后DC对TRALI发病小鼠进行干预后,死亡率显著降低,小鼠肺组织病变显著改善,且效果优于雷帕霉素处理组;与TRALI发病组相比,干预组胸腔积液重量呈现显著减少(P<0.05),但肺脏湿干比和体温差异无统计学意义。结论 通过LPS联合抗体能有效诱导稳定且典型的TRALI小鼠模型,可见先后存在感染性炎症和输血相关炎性物质是TRALI发病的决定性因素。同时,雷帕霉素处理后DC对感染后TRALI具有保护作用,有望成为干预TRALI恶化的潜在的细胞治疗策略。

同种异基因抗原特异性调节性T细胞的体外扩增

目的建立用人B淋巴细胞体外获得大量的同种异基因抗原特异性调节性T(Treg)细胞的方法,以此检测扩增细胞的表型及其免疫无能性和免疫抑制性。方法第1轮扩增将免疫磁珠分选的人CD4+CD25+T细胞和人B淋巴细胞按1∶4体外混合培养,并加入外源白介素-2(IL-2)和抗-CD28;将第1轮扩增得到的Treg细胞用抗-CD3/CD28包被的免疫磁珠和IL-2刺激,做第2轮扩增以获得更多数量的抗原特异性Treg细胞,分为添加和或未添加免疫抑制剂雷帕霉素(RAPA)2组(n=3)。结果经过2轮的扩增后,在第2轮扩增中未添加RAPA组扩增1×103倍,纯度>80%;添加RAPA组扩增0.8×103倍,纯度>90%。添加RAPA组得到的Treg细胞的Foxp3、CT-LA4、CD39表达水平高于未添加RAPA组,但是HLA-DR变化不大;未添加RAPA组扩增得到的Treg细胞分泌低水平的IL-2、IL-17、IL-4和IFN-γ,而添加RAPA组得到的Treg细胞几乎不分泌上述各种细胞因子,前者表现出部分免疫反应无能性,后者表现出完全的免疫反应无能性,两者都表现出免疫抑制性功能特征。人B淋巴细胞扩增得到的抗原特异性Treg细胞能够极大地抑制同源抗原引起的免疫反应,而对多克隆刺激的免疫反应抑制能力较弱。结论用人B细胞体外扩增抗原特异性Treg细胞,再通过抗-CD3/CD28包被的免疫磁珠进一步刺激可以体外获得大量的抗原特异性的Treg细胞,加入RAPA后可有效地提高Treg细胞的纯度和免疫抑制力且呈现抗原特异性。

血红蛋白类氧载体研究现状

介绍了目前比较有代表性的几类血红蛋白类氧载体的研究现状,着重介绍了第一代血红蛋白类氧载体存在的氧化性损伤问题和第二代偶联抗氧化酶的血红蛋白类氧载体的发展前景。

抗氧化酶交联的多聚血红蛋白对H_2O_2引起的血管内皮细胞氧化损伤的保护作用

目的探讨交联了抗氧化酶的聚合人血红蛋白对过氧化氢(hydrogenperoxide,H2O2)引起的血管内皮细胞氧化损伤的保护作用。方法按照对细胞处理方法的不同,分为正常对照组、单加H2O2组、抗氧化酶交联的多聚血红蛋白(PolyHb-SOD-CAT)+H2O2组、多聚血红蛋白(PolyHb)+H2O2组、单加PolyHb-SOD-CAT组和单加PolyHb组,化学比色法检测细胞内还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)、Ca2+浓度,免疫组化技术检测核转录因子NF-kB在细胞内的分布,RT-PCR技术检测血红素氧化酶(heme oxygenase,HO-1)、内皮型一氧化氮合酶(endothelialnitric oxide synthase,eNOS)的mRNA表达情况,流式细胞术检测细胞死亡情况。结果与对照组相比,单加H2O2组的GSH浓度为(0.006 4±0.003 9)mmol/L,Ca2+浓度为(690.05±145.11)nmol/ml,NF-kB大量位移入核,HO-1、eNOS的mRNA表达量上升,细胞死亡率高;而与单加H2O2组比,PolyHb-SOD-CAT+H2O2组的GSH浓度为(0.0214±0.009 8)mmol/L,Ca2+浓度为(172.43±24.09)nmol/ml,NF-kB绝大部分仍位于胞浆内,HO-1、eNOS的mRNA表达量明显降低,细胞死亡率下降。结论PolyHb-SOD-CAT能够抑制H2O2引起的血管内皮细胞氧化损伤。

可作为细胞治疗制品的CD8调节性T细胞的体外诱导扩增方法

目的建立1种可用于细胞治疗制品的CD8调性T细胞（CD8＋Reularory T cell,Treg）的体外诱导扩增方法,并检测所获Treg细胞性质及功能的稳定性。方法通过免疫磁珠从人外周血PBMC中分选出CD8＋T细胞,在抗人-CD3/CD28磁珠与外源性IL-2激活下,联合使用不同组合的诱导因子：转化生长因子1（TGF-β1）、雷帕霉素（Rapamycin,RAPA）和全反式维甲酸（All-trans retinoic acid,ATRA）,多克隆诱导扩增出CD8＋Treg细胞,比较不同诱导组CD8＋Treg细胞扩增能力、表型、细胞内因子分泌、抑制功能等情况,筛选出最合适的诱导组细胞,进行体外多轮重刺激扩增并检测其功能及性质的稳定性。结果对不同组CD8＋Treg细胞扩增数量、表型、细胞内因子分泌情况分析得出：TGF-β1和雷帕霉素联合诱导组细胞高表达Foxp3和CD103,扩增能力强,对同种异基因CD4效应T细胞抑制功能可达90%以上、炎性因子IL-2和IFN-γ分泌细胞比例低、在炎性条件下不分泌IL17A和分泌很低量的IFN-γ。体外进行四轮重刺激,扩增倍数最低可达10000倍,且扩增所获Treg细胞活性高,Foxp3表达稳定,各轮抑制功能无显著差别。对Treg抑制作用机制研究发现,Treg通过竞争性消耗内源性IL-2起到部分抑制功能。结论 CD8＋Treg细胞体外扩增诱导方法的建立将填补了目前CD8＋Treg培养方法上的空白。体外大量扩增的CD8＋Treg细胞具有治疗自身免疫病、GVHD等疾病的应用潜力,可作为1种细胞治疗制品运用于临床。同时,通过利用原本在输血中废弃的PBMC,诱导出功能稳定的CD8＋Treg细胞,在一定程度上提高了血液的利用效率和促进了成份输血的进程。

胶原诱导性关节炎炎症条件下诱导的调节性T细胞与B细胞的相互作用

目的:探讨胶原诱导性关节炎(CIA)小鼠炎症条件下,诱导的调节性T细胞(i Tregs)与B细胞的相互作用模式。方法:分别从正常DBA1/J和免疫后第35天的关节炎小鼠的脾脏细胞分选出CD19+细胞(N-B和CIA-B细胞),以此细胞作为抗原提呈细胞观察其诱导Tregs生成的差异;经典方法制备i Tregs,将CIA-B细胞与i Tregs共培养,观察其对i Tregs自身的增殖及i Tregs表达CTLA-4的影响;观察i Tregs对CIA-B细胞共刺激分子(CD80,CD86)和MHCⅡ类分子表达的影响,并设立Transwell实验探讨作用机制。结果:CIA-B较N-B诱导更多Tregs的生成;CIA-B促进i Tregs的增殖并上调i Tregs细胞表面CTLA-4的表达,后者的作用是通过细胞直接接触的途径实现;同时,i Tregs促进CIA-B细胞表面共刺激分子和MHCⅡ类分子的表达且该作用也通过细胞直接接触途径而实现。结论:在CIA炎症条件下,i Tregs通过与B细胞的相互作用来发挥其免疫抑制作用,两者的相互作用通过细胞直接接触实现。

烟碱对胶原诱导小鼠关节炎的作用

为观察烟碱对胶原诱导关节炎模型小鼠的作用,并初步探讨其免疫学和分子机制,建立胶原诱导关节炎模型,以PBS溶液喂饲模型小鼠为对照,采用半定量评分系统和病理切片评价关节炎模型小鼠对照组和烟碱实验组的病情进展。并采用流式细胞术分别测定对照组和烟碱实验组小鼠脾脏CD4+细胞表型;RT-PCR方法检测对照组和烟碱实验组脾细胞Th1/Th17相关细胞因子IFN-γ、IL-17A、IL-21、IL-22,以及促炎症因子IL-6,抑炎症因子IL-10 mRNA的表达变化。流式CBA法检测模型小鼠血浆TNF-α含量。结果,采用烟碱喂饲关节炎模型小鼠能够有效减缓关节炎病症进展,减轻模型小鼠关节炎症状。病理切片显示对照组小鼠患处充血、水肿及中等量炎症细胞浸润;而相应烟碱实验组小鼠病理症状较轻。相比对照组,烟碱实验组Th17细胞比例明显降低(7.63%vs 12.53%);且烟碱实验组IL-17A、IFN-γmRNA比值低于对照组,具有显著性差异,P<0.05。烟碱干预能有效降低实验小鼠IL-6、IL-21 mRNA含量,P<0.05。另外,烟碱实验组小鼠血浆TNF-α含量明显低于对照组(10.82±2.22)pg/ml和(30.14±4.12)pg/ml,两者具有显著性差异,P<0.01。提示,烟碱干预能够有效减缓关节炎小鼠病症进展,减轻小鼠关节炎症状;这一效应是通过降低Th17细胞比例、降低炎症因子IL-17A/IFN-γ比例,减少IL-6、IL-21、TNF-α等多因素共同参与的过程。