人vigilin基因全长编码区的分段克隆及鉴定

目的为了探讨全长VIGILIN、VIGILIN的N端、VIGILIN的C端以及不同KH组合的功能,采取5分段扩增的策略克隆全长vigilin基因。方法根据vigilin基因全长编码区内的限制性核酸内切酶位点,将vigilin基因全长编码区分为5段。从意外死亡健康成人肝组织中提取总RNA,RT-PCR分段扩增目的基因,克隆至pUC118载体,测序,并亚克隆至pUC118载体,对接头部位测序。结果获得8个大小不同的人vigilin基因编码区片段和全长编码区。重组全长vigilin质粒pC118/vigilin(12+345)经测序,与GenBank上登陆的人vigilin cDNA(NM:005336)序列完全一致。结论用分段克隆的方法成功获得了人vigilin基因的全长编码区。

TRAIL蛋白原核表达载体的构建及表达研究

目的 利用蛋白自剪切功能原核表达系统构建肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）胞膜外段融合蛋白表达载体，并进行表达条件优化和初步纯化。方法 设计基因拼接引物，合成TRAIL基因胞膜外段双链cDNA序列，将其连接于克隆载体pMD18-T中；将酶切、纯化的TRAIL基因与经相同处理的载体pTWIN1相连接，转化感受态大肠杆菌JM109，筛选阳性重组子。将鉴定（酶切及序列分析）阳性的重组子质粒转人大肠埃希菌ER2566表达菌中，采用蛋白质SDS—PAGE电泳方法分析不同浓度诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）、不同诱导温度、不同诱导时间下目的蛋白表达情况。结果 成功获得了包含TRAIL基因胞膜外段的双链cDNA序列，酶切及序列分析证实成功构建了TRAIL胞膜外段蛋白自剪切功能原核表达载体。采用0．3mmol／LIPTG、15℃诱导过夜（14～16h），目的蛋白获得较高表达量，且大部分为可溶性蛋白。结论 采用大肠埃希氏菌ER2566，TRAIL胞膜外段融合蛋白获得高表达，经简单后续处理即可获得不含任何额外氨基酸的可溶性目的蛋白。

人自剪切TRAIL胞外段融合蛋白表达条件的优化

目的:在已构建肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)胞膜外段融合蛋白的原核表达载体基础上,进行表达条件优化,使其高表达为进一步研究其活性奠定基础。方法:将前期构建的PCS/TRAIL 111-281原核表达载体转入大肠埃希菌BL21中,15%SDS-PAGE比较分析不同诱导剂浓度、诱导温度和诱导时间对融合蛋白表达量的影响。结果:在诱导温度15℃,加入0.2 mmol/L诱导剂(isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG)、诱导过夜时可以获得较高的可溶性融合蛋白表达量。结论:诱导剂浓度、诱导温度、诱导时间对融合蛋白表达量有较大的影响。

多媒体在医用生物化学教学应用中的利弊

医学生物化学是重要的医学基础课程之一，其发展迅速、应用广泛。医学生物化学教学内容已从传统的物质代谢为中心变为以遗传信息表达与调控为中心的分子生物学模式，并新增大量的现代实验技术。教学内容增多．内容抽象，概念繁多，但是当前医学院校的生物化学学时相对压缩，使得该课程讲授和学习的难度加大。因此．在生物化学教学中应用多媒体课件成为一种能较好地适应现代教学的新方法。多媒体教学可以将声音、影像、文字、色彩等多种信号集于一体，将微观、抽象的多种信息直观、生动形象地体现出来，

急性缺血再灌注肾损伤过程中Mg^(2+)及K^+协同胰岛素的对抗效应

目的:在肾移植术后可能发生急性缺血再灌注性肾损伤。作者前期实验表明在肾缺血再灌注期间注射胰岛素可减轻缺血再灌注肾损伤,在此基础上,在胰岛素溶液中加入天冬氨酸钾镁,观察Mg2+,K+协同胰岛素对家兔急性肾缺血再灌注损伤的影响,并分析其可能机制。方法:实验于2002-02/04在泸州医学院生理实验室完成,动物实验方法符合动物伦理学要求。①实验材料及方法:选用健康成年日本大耳白兔27只,按随机数字表法分为3组(n=9),即缺血再灌注组、缺血再灌注胰岛素处理组及对照组,前两组采用钳夹肾动脉法建立急性肾缺血再灌注肾损伤模型,缺血再灌注胰岛素处理组再灌注的同时给予胰岛素溶液,含胰岛素3U/kg,葡萄糖1.5g/kg,K+4mg/kg,Mg2+1.7mg/kg。②实验评估:分别观察3组动物缺血再灌注2h,48h后,血清尿素氮、血糖、血清及肾组织中丙二醛含量以及肾组织超微结构变化。结果:23只动物进入结果分析。①肾缺血再灌注48h后,缺血再灌注组血清尿素氮含量显著高于对照组(P<0.01),缺血再灌注胰岛素处理组与对照组差异无显著性意义(P>0.05)。②缺血再灌注组血清及肾组织中丙二醛含量显著高于对照组(P<0.05),缺血再灌注胰岛素处理组丙二醛含量显著低于缺血再灌注组(P<0.05)。③缺血再灌注2h后,3组动物血糖均较术前增高,但以缺血再灌注组增高更为显著,与对照组比较差异具有显著性意义(P<0.05),缺血再灌注胰岛素处理组与对照组差异无显著性意义(P>0.05)。④对照组肾组织超微结构正常,缺血再灌注组肾组织呈变性和坏死改变,缺血再灌注胰岛素处理组肾组织轻度变性。结论:Mg2+,K+可协同胰岛素减轻家兔急性缺血再灌注性肾损伤,其作用途径可能和降低血糖、抗自由基损伤、改善能量代谢、减轻钙超载、防止低血钾等因素有关。

蛋白质组学在肿瘤防治研究中的应用

随着人类基因组测序计划 (humangenomesequenceproject)的完成 ,产生了蛋白质组学 (proteomics) --研究细胞内全部蛋白质的组成及动态变化的一门新兴学科。恶性肿瘤是一种多种基因和蛋白质参与的复杂疾病。综述了在肿瘤防治中蛋白质组学的主要策略和技术 ,及其在肿瘤标志物的筛选和鉴定、肿瘤分类、预后、治疗效果的评价及肿瘤发生机制等方面的研究。

人可溶性TRAIL cDNA的设计、合成与克隆

目的:合成可溶性的肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)的cDNA,并构建其原核表达载体。方法:根据大肠杆菌密码子偏好性和表达载体多克隆位点限制性内切酶要求,设计基因拼接引物,合成TRAIL基因胞膜外段双链cDNA序列,将其连接于克隆载体pMD18-T中;将酶切、纯化的TRAIL基因与经相同处理的载体PSC相连接,转化感受态大肠杆菌JM109,筛选阳性重组子。结果:成功获得了包含TRAIL基因胞膜外段的双链cDNA序列,并成功构建了TRAIL胞膜外段原核表达载体PSC/TRAIL111-281。结论:采用PCR的方法,实现合成寡核苷酸片段的一次性组装,方便了进一步的克隆。

中药成分CDP对乳腺癌细胞P16,E-CADHERIN去甲基化作用的研究

目的探讨中药成分CDP对乳腺癌细胞系T47D和MDA-MB-435的抑癌基因P16和E-CADHERIN启动子区CpG岛的去甲基化作用。方法培养人乳腺癌细胞系T47D和MDA-MB-435,分别用不同剂量、同一剂量不同时间的CDP和5-azacytidine(5-aza-C)处理细胞;用甲基化特异性PCR(MSP)和半定量RT-PCR,检测细胞中P16和E-CADHERIN基因的甲基化改变和RNA表达恢复情况。结果①在25、50、75和100μmol/L剂量的CDP持续作用6d后,T47D细胞P16基因启动子区CpG岛甲基化特异性条带减弱,在100μmol/L剂量时消失,在4个剂量CDP作用下,非甲基化特异性条带均重新出现;在75和100μmol/L浓度作用下时,T47D细胞中出现P16基因重新表达;②在50μmol/LCDP作用144h后,T47DP16基因启动子区CpG岛甲基化特异性条带仍存在;非甲基化特异性条带24h出现并持续到144h;在药物作用144h时,P16出现表达。③在MDA-MB-435细胞中,用不同剂量CDP处理或同一剂量CDP处理不同时间后,均未观察到E-CADHERIN非甲基化条带的出现,RT-PCR也未检测到E-CADHERIN基因的表达。结论在T47D细胞中,中药成分CDP可以剂量、时间依赖的形式逆转高甲基化的P16基因,而对MDA-MB-435细胞中高甲基化的E-CADHERIN基因无效,提示CDP药物存在靶分子反应多样性。

人VIGILINN端融合蛋白的表达及亚细胞定位

目的原核表达人VIGILINN端基因,制备抗人VIGILIN的多克隆抗体,对人VIGILIN作亚细胞定位。方法用PCR扩增人VIGILIN基因N端,克隆到表达载体pGEX-4T-2中,并在大肠杆菌中以IPTG诱导表达。产物经Glutathion Sepharose 4B纯化后免疫新西兰白兔制备抗人VIGILINN端融合蛋白抗体,采用ELISA和Western blot鉴定抗体的效价及特异性。通过细胞免疫荧光染色,观察VIGILIN在细胞中的分布。结果在28℃1、mmol/L IPTG诱导3 h的最优条件下成功表达GST-VIGILIN N端融合蛋白,抗体ELISA滴度为1∶16000,Western blot证实抗体特异性较高,VIGILIN在细胞质和核中均有分布,核中的分布集中在核膜内侧和靠近DAPI染色显著的区域。结论成功表达人VIGILIN N端融合蛋白和制备兔抗人VIGILIN抗体,并应用于亚细胞定位,为研究人VIGILIN的性质和功能奠定基础。

人VIGILIN的shRNA真核表达质粒的构建及其对肝癌细胞周期影响的初探

目的构建靶向人高密度脂蛋白结合蛋白(VIGILIN)的shRNA真核表达载体,并初步探索VIGILIN与人肝癌细胞系HepG2细胞周期是否有关联。方法构建人VIGILIN的shRNA重组质粒,并将重组质粒pSIREN-VIG转染HepG2细胞,采用RT-PCR和Western-blot检测HepG2细胞VIGILIN mRNA和蛋白的表达,并用流式细胞术检测细胞周期是否有所改变。结果1HepG2细胞转染pSIREN-VIG后,VIGILIN的表达被特异、有效地抑制。转染48h后,VIGILIN的表达从mRNA和蛋白的水平都有明显的减少;2VIGILIN表达抑制后,G2/M期细胞所占比例增加:相对于三个对照组(未转染组2.4%,脂质体转染组4.9%和转染pSIREN-GFP组6.5%),实验组(转染pSIREN-VIG组)G2/M期细胞增加到9.4%。结论我们成功的构建了能特异、有效的抑制人VIGILIN表达的shRNA表达质粒,人VIGILIN能够影响到细胞周期的正常运行,导致G2/M期阻滞。

多功能转录因子CTCF重组质粒构建及其表达鉴定

目的构建人CTCFcDNA全长及N端、Zn指、C端3个片段的原核融合表达载体,纯化融合蛋白并进行鉴定。方法以编码CTCF全长序列的质粒为PCR模板,分别构建GST融合表达重组质粒pGEX-4T-2-CTCF,pGEX-4T-2-CTCF-N,pGEX-4T-2-CTCF-Zn,pGEX-4T-2-CTCF-C,转化大肠杆菌BL21,酶切、测序鉴定;优化IPTG诱导表达条件,并对亲和层析纯化的GST融合蛋白CTCF,CTCF-N,CTCF-Zn,CTCF进行Far-Western blot鉴定。结果重组质粒经双酶切和测序鉴定证实构建成功。GST融合蛋白CTCF,CTCF-N,CTCF-Zn,CTCF-C均在大肠杆菌中成功诱导表达,融合蛋白经亲和层析纯化获得纯化蛋白。各纯化蛋白经SDS-PAGE和Far-Western blot鉴定,均为诱导表达蛋白质。结论成功构建了GST融合表达CTCF,CTCF-N,CTCF-Zn,CTCF-C的重组质粒,对融合蛋白表达条件进行了优化,获得了高效表达的GST融合蛋白。

构建小鼠肝细胞磷酸化蛋白质组分析鉴定的方法模型

背景：磷酸化蛋白质组的分析鉴定是目前蛋白质组学技术研究的主要目标之一，然而以质谱为核心的鉴定技术尚不完善。目的：建立一种简便易行、适于在一般实验室普及的分析鉴定磷酸化蛋白质组的方法并应用于小鼠肝细胞磷酸化蛋白质组的模型。设计、时间及地点：观察对比实验，于2003-07／2004-06在泸州医学院生物化学教研室及医学分子生物学实验室完成。材料：封闭群乳昆明小鼠100只，年龄1-3d，体质量3-6g，雌雄各半；^32P-NaH2PO4由中国北京原子能研究所提供。方法：将长势相当的体外培养的乳小鼠肝细胞随机分成两组。一组作同位素^32P标记后液氮终止反应，裂解细胞，收集蛋白并定量，双向电泳分离蛋白，干胶及放射自显影，建立小鼠肝细胞磷酸化蛋白质组的放射自显影图谱，初步确定6种靶标磷酸化蛋白EPs15等；另一组直接裂解细胞，收集蛋白并定量，双向电泳分离蛋白后半干式电转移至PVDF膜，根据靶标蛋白EPs15等的理论等电点和分子量剪下6张小膜。主要观察指标：采用持久性化学发光检测技术确证初步鉴定的6种靶标蛋白EPs15等。结果：①小鼠肝细胞磷酸化蛋白质组的放射自显影图谱显示约100个蛋白质斑点，经PDQuest 2D软件结合蛋白质数据库初步鉴定出已知的6种磷酸化蛋白EPs15等。②6种靶标蛋白的免疫印迹-化学发光图谱上均只出现了1个特异蛋白质斑点，与放射自显影图谱上的斑点基本匹配。结论：实验建立的同位素标记结合免疫印迹-化学发光的方法分析鉴定磷酸化蛋白质组简单、实用、灵敏、高效。

一氧化氮在胰岛素抗急性缺血再灌注肾损伤中的作用研究

目的 :观察NO在胰岛素抗急性缺血再灌注 (IR)肾损伤中的作用 ,进一步探讨胰岛素减轻肾缺血再灌注损伤的作用及其机制。方法 :采用肾动脉钳夹法建造急性缺血再灌注性肾损伤模型。将家兔分为对照组、单纯缺血再灌注 (IR)组、胰岛素处理 (Ins-IR)组。观测三组动物缺血再灌注 2小时、48小时时 ,肾组织一氧化氮 (NO)含量、血清尿素氮 (BUN)水平、血清及肾组织中丙二醛 (MDA)含量 ,和肾组织超微结构的改变。结果 :肾缺血再灌注 2小时和 48小时时 ,IR组肾组织中NO含量明显降低 (P <0 .0 0 1) ,胰岛素处理组NO水平维持在正常水平。相应的缺血再灌注 48小时时的血清尿素氮水平 ,IR组较对照组显著升高 (P <0 .0 0 1) ,Ins -IR组与对照组差异无显著性(P >0 .0 5 ) ;血清及肾组织中MDA含量IR组较对照组显著升高 (P <0 .0 5 ) ,胰岛素处理组MDA含量明显降低 (P <0 .0 5 ) ;肾组织切片电镜观察显示 ,对照组超微结构无改变 ,IR组肾组织有变性和坏死 ,而Ins -IR组肾组织仅轻度变性。结论 :促进NO的生成是胰岛素抗肾IR损伤的重要环节 ,可能与NO清除氧自由基 ,减轻肾组织IR损伤中的无复流现象等作用有关。

国库集中收付制度改革浅议

文章分析了我国国库集中收付制度改革所取得的巨大成效,同时指出改革中面临的问题,提出改进措施。

浅论企业财务预算

市场经济中,企业面临诸多的风险,通过编制有效的预算是防范企业风险的一项重要措施。文章分析了如何编制及实施财务预算,同时在企业中建立财务预算管理理念,全面运用企业财务预算,提高企业经济效益。

乳小鼠培养肝细胞蛋白质双向电泳技术的建立

目的 :建立培养乳小鼠肝细胞蛋白质的双向电泳技术。方法 :取乳小鼠肝脏组织 ,进行肝细胞原代培养 ,提取肝细胞蛋白 ,以固相pH梯度 (IPG)等点聚焦为第一向 ,垂直SDS -PAGE为第二向进行双向电泳 ,并对样品处理方式、蛋白上样量、IPG等电聚焦和SDS -PAGE电泳参数设置、凝胶浓度等关键因素和环节进行了比较研究。结果 :通过实验条件的筛选和优化获得了较满意的双向电泳图谱。结论 :本文建立乳小鼠双向电泳分离技术 ,具有较高的分辨率和重复性 。

人白细胞蛋白质的提取及双向电泳分析

目的 :建立人白细胞蛋白质提取及双向电泳分析方法 ,为构建白细胞在不同生理或病理条件下的蛋白质表达谱或进行蛋白质表达的差异分析奠定基础。方法 :取人全血 ,分离白细胞 ,提取蛋白质 ,双向电泳分离 ,考马斯亮蓝R - 2 5 0染色获得蛋白质的电泳分离图谱 ,利用PDQuest2D分析软件进行图像分析 ,结合SWISSSPORT蛋白质数据库对白细胞蛋白质斑点进行初步鉴定。结果 :所得双向电泳图谱中各点分离清晰 ,无明显横向或纵向拖尾 ,分析显示图谱上有 2 12个蛋白质斑点 ,主要集中在pH4 .75～ 6 .81之间 ,其中高丰度蛋白斑点有 36个点 ,低丰度的蛋白质斑点约 176个 ,对其中 6个高丰度蛋白质斑点初步鉴定可知这些蛋白质为 :CAN2 (MW :77975 .95pI:4 .84 )、I17R(MW :94 4 15 .6 3pI:4 .90 )、CARF(MW :5 130 2 .6 5pI:5 .82 )、FIG1(MW :6 8184 .0 6pI:6 .2 9)、PIGR(MW :82 96 9.32pI:5 .2 2 )、F16P(MW :36 781.2 8pI:6 .18)。结论 :本实验建立了人白细胞蛋白质的双向电泳分析方法 ,图谱分离、染色效果好 ,能满足 2 -DE专业软件分析的要求 ,为后续白细胞的蛋白质组研究奠定了基础。

用重叠延伸PCR技术纠正人工合成乙型肝炎病毒核心抗原基因中的突变

目的:利用重叠延伸PCR技术纠正人工合成乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)基因中的突变碱基。方法:针对构建的重组质粒PGEM-7Z/HBcAg中的两处突变设计三对引物,PCR定点突变后对重新构建的PGEM-7Z/HBcAg进行菌落PCR和酶切鉴定,初步筛选的阳性克隆进一步通过序列分析进行确证。结果:经PCR定点突变后,测序证明HBcAg基因序列与设计完全一致。结论:用该方法成功纠正了人工合成的乙肝病毒核心抗原基因中两个碱基的缺失,获得了预期的目的基因。