复方中药提取物对公兔生殖生理的影响

【目的】讨论不同剂量复方中药提取物对公兔精液品质、生殖激素、睾丸形态及精子顶体完整性的影响,为提高公兔的繁殖性能及研制此类功能的中药饲料添加剂提供理论依据。【方法】选取24只新西兰公兔,随机分为4组,每组6只,空白对照组公兔不添加复方中药提取物,试验Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组公兔分别添加150、300、600 mg/kg复方中药提取物。试验周期为12周,饲喂周期为8周。分别于试验第4、8、12周采集血液样本,于试验第8、10、12周采集精液样本,进行血清中性激素的测定与精液品质鉴定。【结果】与对照组相比,8~12周试验组兔精子密度、精子活率、A级精子数量均显著升高(P<0.05),试验Ⅲ组兔精子顶体完整率显著升高(P<0.05);10~12周试验Ⅲ组兔精子畸形率显著降低(P<0.05)。试验组兔睾丸组织表面被膜由较厚的不规则致密结缔组织构成,睾丸内大量曲精小管基底膜清晰可见,曲精小管上皮是由生精细胞与支持细胞构成的复层上皮,曲精小管上皮分布大量精原细胞和分化的精母细胞,管腔内可见数量丰富的精子,间质无明显异常。4~12周试验Ⅱ、Ⅲ组兔血清中促卵泡素(FSH)、黄体生成素(LH)、睾酮(T)含量均显著高于对照组(P<0.05)。【结论】复方中药提取物可明显改善公兔精液品质,提高精子顶体完整率,降低精子畸形率;有效改善睾丸形态,促进生殖器官发育;提高血清中FSH、LH、T生殖激素含量。其中600 mg/kg复方中药提取物对于公兔的生殖生理具有显著影响,在实际生产中具有良好的应用前景。

延边黄牛体细胞克隆胚胎氧化损伤的初步研究

为了优化体细胞克隆胚胎体外培养液,提高体细胞的克隆效率,以CR1aa+5%FBS+0.3%BSA为基础培养液,分别添加0、60、80、100和120μmol/LH2O2观察延边黄牛体细胞克隆胚胎的氧化损伤情况和体外发育模式,并研究1、4和7 mmol/L GSH对延边黄牛重组胚的保护作用。结果表明:(1)添加0、60、80μmol/LH2O2组卵裂率显著要高于100μmol/L和120μmol/L组(P<0.05),添加H2O2的组囊胚发育率显著低于未添加组(P<0.05);(2)随着H2O2处理浓度的升高,重组胚发育速度增加,但是发育停滞现象也更明显;(3)在培养液中添加GSH后,1 mmol/L组卵裂率显著高于7 mmol/L组(P<0.05),与0和4 mmol/L组差异不显著(P>0.05),囊胚发育率显著高于其它组(P<0.05)。可见,在体细胞克隆胚胎体外发育过程中H2O2对其具有氧化损伤作用,不利其体外发育,在培养液中添加1 mmol/L GSH对体细胞克隆胚胎的氧化损伤具有明显的保护作用。

延边黄牛核移植胚胎的活性氧含量的测定

为了研究延边黄牛体细胞克隆胚胎内部的活性氧水平,以延边黄牛孤雌激活胚胎为对照,用2,′7′-二氯荧光素二乙酸酯和二氢乙锭两种染料分别对体细胞克隆胚胎进行染色,测定其内部超氧阴离子和过氧化氢含量。结果表明,2细胞期处理组间超氧阴离子水平差异不显著(P>0.05),其它细胞期体细胞克隆组均显著高于孤雌激活组(P<0.05),过氧化氢水平各细胞期体细胞克隆胚胎均显著高于孤雌激活胚胎(P<0.05)。因此,延边黄牛体细胞克隆胚胎氧化损伤水平显著高于孤雌激活胚胎。

延边黄牛体细胞核移植胚胎编码抗氧化酶的基因表达研究

为研究延边黄牛体细胞核移植(SCNT)胚胎编码过氧化氢酶(CAT)、锰超氧化物酶(Mn-SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的mRNA表达情况,以孤雌激活(PA)胚胎为对照,利用反转录PCR扩增延边黄牛SCNT胚胎编码CAT、Mn-SOD和GPx的mRNA,琼脂糖凝胶电泳后使用计算机软件进行半定量分析。结果显示:延边黄牛SCNT胚胎编码CAT的基因在2细胞期开始表达,且与PA胚胎存在显著差异(P<0.05);编码Mn-SOD的基因在8细胞期开始表达,与PA胚胎在16细胞期以上时期差异显著(P<0.05);编码GPx的基因在4细胞期开始表达,与PA胚胎在4细胞期差异显著(P<0.05),8细胞期以上时期差异不显著(P<0.05)。与孤雌激活胚胎的差异表明SCNT胚胎抗氧化酶表达的异常可能是由核移植操作过程所引起的。

过氧化氢和谷胱甘肽对延边黄牛体细胞克隆胚胎氧化损伤的影响

在延边黄牛体细胞克隆胚胎体外培养液中分别添加H2O2和GSH,观察重组胚体外发育情况,探究二者对延边黄牛体细胞克隆胚胎氧化损伤的影响。结果表明:不同时间添加H2O2时0～24 h组卵裂率显著高于其它组(P<0.05),48～72 h组16细胞以上发育率显著低于其它处理组(P<0.05)。不同时间不添加H2O2时48～72 h组16细胞期以上发育率显著高于0～24 h组和24～48 h组(P<0.05),24～48 h组显著高于0～24 h组(P<0.05)。不同时间添加GSH时0～24 h组和24～48 h组卵裂率显著高于对照组、48～72 h组和72～96 h组(P<0.05),对照组16细胞以上发育率显著低于48～72 h组和72～96 h组(P<0.05)。结论:H2O2对延边黄牛体细胞克隆胚胎发育前期的氧化损伤较大,特别是在48～72 h。培养前期添加1 mmol/L的GSH能够有效提高延边黄牛体细胞克隆胚胎体外发育效率,缓解有害应激带来的氧化损伤。

延边黄牛体细胞克隆激活条件的研究

从激活前恢复时间、激活方式、激活培养时间等3个方面研究延边黄牛体细胞克隆的适宜激活条件．结果表明：延边黄牛体细胞克隆激活的理想条件为激活前恢复培养25～30min，采用离子霉素（Ionomycin，Ion）＋6-Dimethyaminopurin（6-DMAP）激活方式，激活培养4h．

斜面上任意抛射的最佳抛射角

对斜面上任意抛射的最佳抛射角和射程计算公式进行了推导.

延边黄牛体细胞克隆融合条件的研究

以体外成熟培养22~24 h的延边黄牛卵母细胞作为受体,颗粒细胞为供核细胞,挤压法去核,注入供体颗粒细胞到卵黄周隙中,甘露醇融合液中施加20μs时长的电脉冲刺激使之融合,复合化学方法激活,从融合前恢复培养时间、融合电场强度、甘露醇浓度等3个方面研究延边黄牛体细胞克隆的适宜融合条件.结果表明,2.5 h处理组的融合率(70.9%)显著高于4.0 h处理组(58.2%,P<0.05),2.5 h处理组重组胚的卵裂率(77.9%)显著高于其它4组(P<0.05),其它各组间差异不显著(P>0.05);融合电场强度1 100 V/cm处理组的融合率(86.4%)显著高于900 V/cm处理组(67.1%)和1 200 V/cm处理组(75.2%,P<0.05),重组胚的卵裂率(84.6%)显著高于900 V/cm处理组(69.6%,P<0.05),囊胚发育率(26.1%)显著高于900 V/cm处理组(10.0%),1 200 V/cm处理组(8.0%,P<0.05);不同浓度的甘露醇对融合率和重组胚的卵裂率没有明显的影响,但是0.28 mol/L组囊胚发育率(25.3%)显著高于0.25 mol/L组(15.3%,P<0.05).因此,适合延边黄牛体细胞克隆的融合条件为融合前恢复培养2.5 h,0.28 mol/L甘露醇作为融合液,电场强度1 100 V/cm.

多元线性模型预测穿琥宁注射液稳定性的实验研究

目的 :研究穿琥宁注射液的稳定性 ,预测其储存期。方法 :以高效液相色谱 二极管阵列检测为定性定量方法 ,以一级动力学模型描述其降解过程 ,以多元线性模型预测其室温储存期。结果 :测得有 2种主要降解物 ,穿琥宁注射液的室温储存期为 10个月。结论 :穿琥宁注射液的热稳定性较差 ,UV法不适合于本制剂的稳定性研究。

盐酸加替沙星对兔体内茶碱药动学的影响

目的:研究盐酸加替沙星对家兔体内茶碱药动学的影响.方法:6只家兔于第1,6天单次静脉注射氨茶碱10 mg·kg-1,第2～6天灌服盐酸加替沙星20 mg·kg-1,qd.用氨茶碱后各时间点采静脉血,测定茶碱血清浓度,数据用3P97药动学软件处理,计算参数,并用t检验进行统计处理.兔血清氨茶碱浓度以HPLC法测定.结果:氨茶碱在兔体内的药动学过程呈二室模型,t1/2分别为(0.21±0.04)h和(0.33±0.21 )h;t1/2β分别为(4.4±0.8)h和(4.8±1.1)h ;AUC分别为(72.9±10.6)g·h·mL-1和(80.7±20.3)g·h·mL-1;CL分别为(139.7±21.7)mL··h-1·kg-1和(131.4±36.3)mL·h-1·kg-1;V(c)分别为(495.3±26.55)mL·kg-1和(462.86±34.71)mL·kg-1.结论:所有参数经双侧t检验,差异无显著性(P>0.05),合用加替沙星对家兔体内氨茶碱药动学无影响.

高效液相色谱法用于注射用穿琥宁及穿琥宁注射液含量测定的实验研究

目的 :测定注射用穿琥宁及穿琥宁注射液含量。方法 :采用高效液相色谱法。色谱柱为ShimpackCLCC18柱 ,流动相为 0 0 2mol·L-1磷酸二氢钾 (pH 3 0 ) -乙腈 -甲醇 (4 0∶10∶5 0 ) ,流速 1 2mL·min-1,检测波长为 2 5 1nm。应用二级管阵列检测器对色谱峰纯度进行检验 ,以排除有关物质的干扰。结果 :平均回收率为99 88% ,RSD为 0 13% (n =3)。方法日内RSD为 0 99% (n =5 ) ,日间RSD为 1 2 % (n =10 )。结论 :方法准确可靠 ,可作为该制剂的定量方法。

哺乳动物卵母细胞冷冻保存技术研究进展

哺乳动物卵母细胞冷冻保存在种质资源保存、胚胎工程技术和人类辅助生殖方面具有重要意义。冷冻保存过程所产生的渗透压差导致卵母细胞体积迅速变化,引起微结构损伤甚至死亡。卵母细胞冷冻保存过程中的体积调控成为近年来的研究热点。文章总结了卵母细胞冷冻方法、冷冻载体、抗冻保护剂的种类及卵母细胞体积调控在细胞冷冻保存过程中的作用等方面的研究进展。

共培养对延边黄牛重组胚体外发育的影响

以新鲜的颗粒细胞作为供核细胞,以延边黄牛MⅡ期去核的卵母细胞作为受体进行体外培养.使用CR1aa培养液培养时卵裂率(83.7%)显著高于TCM-199液和mSOF液组(76.9%和77.4%),但在重组胚的早期发育各阶段都不存在统计学差异(p>0.05).以CR1aa和TCM-199为基础液时,输卵管上皮细胞和颗粒细胞共培养在卵裂率及重组胚的各阶段发育率都有显著提高(p<0.05).结果表明:CR1aa培养液适用于延边黄牛重组胚的体外培养,以CR1aa液+输卵管上皮细胞和TCM-199液+颗粒细胞共培养的形式效果更好(p<0.05).

鹿卵母细胞体外成熟研究进展

卵母细胞体外成熟培养作为现代胚胎生物工程的重要组成部分,是性别控制、体外受精、核移植和转基因等技术成功的前提和关键。本文就卵母细胞来源、培养液成分、培养时间、温度和气相环境等因素对鹿卵母细胞体外成熟的影响进行综述。

梅花鹿-牛异种体细胞核移植操作方法的研究

本研究旨在对梅花鹿-牛异种体细胞核移植(Interspecies somatic cell nuclear transfer,ISCNT)的显微操作方法进行系统研究,从而优化其操作过程。以梅花鹿耳皮肤成纤维细胞为供核细胞,牛MⅡ期卵母细胞为受体,分别采用盲吸法、挤压法和脱羰秋水仙碱(Demecoline,DEME)化学辅助的方法去核,带下注射(Perivitelline microin—jection,PM)、Pizeo破膜细胞胞质内注射(Break—membrane-cell intracytoplasmic microinjection,BMCIM)和全细胞胞质内注射(Whole-cell intracytoplasmic microinjection,WCIM)的方法注核,带下注核的卵母细胞电融合后化学激活,其余方法注核后直接化学激活,重组胚用CR1aa培养液体外培养。结果表明:(1)DEME辅助法去核率最高,挤压法最低,3种去核方法的去核率差异显著(P<0.05),去核时间差异不显著(P>0.05);(2)PM组和WCIM组注核成功率分别为100.0%和94.8%,注核时间分别为31.0和35.1 s,显著低于BMCIM法(P<0.05),但是注核成功率显著高于BMCIM法(P<0.05),而且两者差异不显著(P>0.05);(3)BMCIM组和WCIM组的激活率均显著高于PM组(P<0.05),其中一步法的BMCIM组最高,一步法和两步法在激活率、卵裂率和囊胚率方面均无显著差异(P>0.05)。结果提示:DEME辅助去核、Pizeo辅助破膜胞质内注射的一步法显微操作可有效用于梅花鹿-牛的异种体细胞核移植的研究。

亮甲酚蓝染色对牛卵母细胞体外成熟的影响

研究旨在观察亮甲酚蓝(brilliant cresyl blue,BCB)对牛卵母细胞的染色效果及体外成熟的影响,从而筛选出更高质量的卵母细胞用于胚胎工程研究。从本地屠宰场收集牛卵巢后采用抽吸法获取卵泡液,在体视显微镜下选择卵丘完整、胞质均匀的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)随机分组,分别进行BCB染色时间和不同浓度BCB染色的试验。结果表明,染色90 min后卵母细胞着色率为68.1%,显著高于30、60 min组(P<0.05),辨识难度为"中";39μmol/L组着色率显著高于13μmol/L组(P<0.05),与26、52μmol/L组差异不显著(P>0.05),成熟数最高(62),成熟率显著高于52μmol/L组,与其它组差异不显著(P>0.05);BCB+组和BCB-组的成熟率与对照组比较差异均不显著(P>0.05)。结果提示,39μmol/L BCB染色90 min能有效筛选牛COCs用于IVM,但是并不能显著提高牛卵母细胞的成熟率。

利用冷冻的GV期卵母细胞制备延边黄牛核移植胚胎的研究

研究使用玻璃化冷冻、程序化冷冻和超快速冷冻3种方法冷冻延边黄牛的卵母细胞,确定适宜的延边黄牛核移植受体卵母细胞的冷冻方法。结果显示,3种冷冻方法处理的GV期卵母细胞在成熟率上相似,玻璃化冷冻法得到的卵母细胞形态正常率要高于程序化冷冻和超快速冷冻法(P<0.05),超快速冷冻法回收率最低。采用玻璃化冷冻法,核移植重组胚卵裂率明显高于程序化冷冻和超快速冷冻法(P<0.05),在融合率上,3种方法差异不显著。表明玻璃化冷冻方法对延边黄牛GV期卵母细胞冷冻效果优于程序化冷冻和超快速冷冻方法,是一种较适合延边黄牛核移植的卵母细胞冷冻方法。

不同核成熟抑制剂对延边黄牛卵母细胞发育的影响

通过在卵母细胞成熟液中单独添加卵母细胞核成熟抑制剂——次黄嘌呤(hypoxanthine,HX)、异丁基甲基黄嘌呤(isobutylmethylxantihine,IBMX),研究其对卵母细胞卵丘扩散程度、极体形态以及后期发育的影响。结果表明:抑制剂(HX、IBMX)组卵母细胞卵丘扩散程度与对照组相比差异不显著(P>0.05),抑制剂组第一极体完整率显著高于对照组,但抑制剂组囊胚发育率与对照组相比差异不显著。最终结果提示,虽然HX和IBMX并未明显提高卵母细胞发育潜力,但仍为两种行之有效的核成熟抑制剂。

秋水仙胺诱导牛卵母细胞显核的研究

为了观察秋水仙胺（demecolcine，DEME）诱导牛卵母细胞的显核效果，从吉林省长春市某屠宰场收集牛卵巢后采用抽吸法获取卵泡液，在体视显微镜下选择卵丘完整、胞质均匀的卵丘－卵母细胞复合体（COCs），微滴法体外成熟（in vitro mature，IVM）培养19～22 h，在0．3％透明质酸酶中旋涡振荡去除卵母细胞周围的卵丘细胞，挑选排出第一极体的卵母细胞随机分组，分别进行DEME浓度和作用时间诱导牛卵母细胞显核的研究。结果表明，DEME处理60、90、120 min组间显核率差异不显著（P＞0．05），但是60、120 min组的显核率显著高于DEME处理30 min 组（P＜0．05）。当DEME浓度为0．5μg／mL 时，显核率最高，为78．9％，显著高于0．3、0．4μg／mL 组（P＜0．05），但是与0．6μg／mL 组差异不显著（P＞0．05）。牛的COCs经IVM培养19、20、21、22 h，结果发现培养22 h组显核率最高，显著高于培养19 h组（P＜0．05），但是与培养20、21 h组差异不显著（P＞0.05）。可见牛卵母细胞经IVM培养20～22 h后，用0．5μg／mL DEME处理60 min可以有效诱导其显核。