基于多组学解析布鲁氏菌BvfA对睾丸支持细胞线粒体NADH-泛醌氧化还原酶复合体的影响

【目的】明确布鲁氏菌BvfA对宿主睾丸支持细胞(TM4细胞)的损伤作用,以揭示布鲁氏菌对宿主的致病机制。【方法】利用RNA-Seq双端测序、Label-free蛋白组学技术和LC-MS非靶代谢组学技术分析感染布鲁氏菌S19△bvfA与S19菌株的TM4细胞的组学差异,采用KEGG数据库对差异表达蛋白及差异代谢物通路进行分析,并利用平行反应监测(PRM)对蛋白表达量进行验证。【结果】感染S19△bvfA和S19菌株的TM4细胞差异表达基因共400个,差异表达蛋白共422个,差异代谢产物共271种。多组学联合分析发现,S19△bvfA和S19菌株感染TM4细胞差异表达基因、差异表达蛋白和差异代谢产物共同富集的KEGG通路为内源性大麻素信号通路,在该通路中发现S19△bvfA菌株感染TM4细胞的线粒体NADH-泛醌氧化还原酶复合体(ComplexⅠ)中有20个蛋白表达量下调。PRM验证结果显示,ComplexⅠ中Ndufb11、Ndufa9、Ndufv1、Ndufv2、Ndufs8和Ndufs2蛋白的表达趋势与Label-free蛋白组学技术测定结果一致。【结论】BvfA在布鲁氏菌感染TM4细胞时能引起转录、蛋白质和代谢水平的变化,布鲁氏菌BvfA使睾丸支持细胞线粒体NADH-泛醌氧化还原酶复合体蛋白表达下调。

抑制细菌碳酸酐酶作为应对细菌耐药性的新策略

细菌对抗生素的多重耐药和交叉耐药亟需联合其他有效的靶向替代策略进行控制。碳酸酐酶(carbonic anhydrases,CAs)是催化CO_(2)水合生成HCO_(3)-和H+的可逆反应的一组金属酶超家族,其活性影响细菌的增殖、生物合成及其在宿主体内的持续感染。靶向抑制CAs活性可降低细菌的生存和适应性,并且不会产生与传统抗生素相同的耐药性。细菌CAs有望成为开发尚无临床耐药性的新型抗菌药物靶标。本文对细菌CAs的分类和结构、生理功能以及细菌现有的CA抑制剂(CA inhibitors,CAIs)的研究进展进行了综述,可为新型抗菌药物研发、解决临床耐药问题提供参考。

宁夏地区牛乳肠球菌耐药性分析

【目的】了解宁夏地区奶牛正常乳汁和患乳腺炎乳汁中肠球菌的分布规律及其耐药特征,为宁夏地区奶牛乳腺炎疾病的抗菌药物合理使用提供参考。【方法】对宁夏地区16个规模化奶牛养殖场近3年来1154份乳汁样品(正常乳汁383份,患乳腺炎乳汁771份)进行肠球菌分离,采用形态学观察和生化试验对分离所获的496株肠球菌进行鉴定,通过K-B药敏纸片扩散法测定分离肠球菌菌株对青霉素(PG)、头孢唑林(CFZ)、庆大霉素(GEN)、四环素(TET)、红霉素(EM)、林可霉素(LCM)、链霉素(SM)和万古霉素(VCA)等8种药物的敏感性,并使用PCR方法对分离肠球菌菌株进行四环素类药物耐药基因(tetA、tetB、tetC、tetM)、大环内酯类药物耐药基因(mecA、ermA、ermB、ermC)以及林可胺类药物耐药基因(lsaA、lsaE、lnuG、lnuA)检测。【结果】从1154份乳样中共分离得到496株肠球菌,经鉴定分属6种肠球菌,分别是屎肠球菌、海氏肠球菌、粪肠球菌、蒙氏肠球菌、耐久肠球菌和鹑鸡肠球菌。其中屎肠球菌305株,占分离菌株总数的61.5%;海氏肠球菌124株,占分离菌株总数的25.0%;粪肠球菌27株,占分离菌株总数的5.4%;蒙氏肠球菌21株,占分离菌株总数的4.2%;耐久肠球菌15株,占分离菌株总数的3.0%;鹑鸡肠球菌4株,占分离菌株总数的0.8%。临床分离菌株对林可霉素、四环素、红霉素的耐药率分别达到95.8%,82.7%和80.2%,尤以耐7种药物的菌株为主,达230株(占耐药菌株的46.4%),最常见的耐药谱为PG+CFZ+GEN+TET+EM+LCM+SM。正常乳汁中分离的菌株主要为海氏肠球菌(检出率为73.8%),对林可霉素的耐药率最高(94.5%);患乳腺炎乳汁中分离的菌株主要为屎肠球菌(检出率为89.5%),对四环素的耐药率最高(97.0%)。496株临床肠球菌中有488株检测出携带耐药基因,检出率为98.4%;检测出乳源肠球菌不携带tetA、tetB、tetC、mecA、lnuG和lnuA耐药基因;携带ermA、ermB、ermC、tetM、lsaA和lsaE耐药基因,其携带率分别为51.0%,80.3%,33.2%,88.1%,41.6%和74.4%;最常见耐药基因谱为ermA+ermB+tetM+lsaE+lsaA。【结论】宁夏地区奶牛乳汁中肠球菌耐药性严重,且具有多重耐药性特征,给公共卫生带来潜在危害,应引起高度重视。

重金属介导的抗生素抗性基因接合转移研究进展

抗生素抗性基因(ARGs)在人类-动物-环境之间的跨界面传播和聚集已成为公共卫生和环境生态系统的主要问题,ARGs和携带这些基因的可移动遗传元件(MGEs)已被视为新出现的环境污染物。环境重金属介导的ARGs水平转移增加了ARGs在本土微生物中富集的潜在风险。目前,研究重金属及其它新污染物诱导的ARGs水平转移已成为环境及其相关学科领域的研究热点。该文综述了重金属作为共选择剂对环境中ARGs接合转移的影响,重点从分子生物学角度分析了重金属引起ARGs接合转移增加的相关机制。重金属介导的ARGs接合转移是ARGs丰度增加的主要原因,重金属引起的接合频率的变化主要与其浓度相关,与毒物兴奋效应一致。相关调控机制包括调节活性氧(ROS)的产生、启动SOS反应、增强细胞膜通透性以及影响接合转移相关基因的表达和ATP合成。阐明在污染环境中(复合)重金属以及重金属与抗生素协同,在不同环境条件下增强ARGs水平转移的机制是今后研究的关键方向,可为重金属介导的ARGs环境行为研究提供一定的参考。

鱼腥草素钠联合氨苄西林对表皮葡萄球菌的抗菌作用

目的：检测鱼腥草素钠联合氨苄西林（ AM）对表皮葡萄球菌（ SE）的抗菌作用。方法利用二倍稀释法、微量棋盘法、杀菌效力评估法对8株临床分离的SE进行药物敏感性测定。结果鱼腥草素钠、AM单独对SE的最小抑菌浓度（MIC）分别为12．5～50μg/mL和2～64μg/mL。鱼腥草素钠联合AM作用于8株SE后，鱼腥草素钠和AM的MIC分别下降了8～16倍和4～8倍，部分抑菌浓度指数（FICI）为0．25～0．375，二者联合作用于8株SE的杀菌效力均为协同效应。结论鱼腥草素钠与AM联合对SE具有抗菌协同作用。

苦参碱对多重耐药表皮葡萄球菌整合子intⅠ和dfrA的影响

为探索苦参碱对多重耐药表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis,SE)整合子整合酶(intⅠ)和二氢叶酸还原酶(dfrA)的影响,试验通过纸片扩散法筛选多重耐药菌株、以肉汤稀释法测定苦参碱对SE的最低抑菌浓度(MIC)和最佳逆转条件;通过普通PCR法测定苦参碱对SE整合子intⅠ和dfrA基因碱基序列的影响;通过荧光定量PCR法测定苦参碱对SE整合子intⅠ和dfrA mRNA表达量的影响,结果显示苦参碱亚浓度作用表皮葡萄球菌后对intⅠ、dfrA基因序列无影响;苦参碱对intⅠmRNA表达量具有抑制作用,而对dfrA mRNA表达量影响不大,结果表明在SE体内苦参碱可从mRNA水平上抑制SE intⅠ的表达量。

两种生物碱联合氨苄西林对表皮葡萄球菌抗菌作用研究

检测盐酸小檗碱和苦参碱联合氨苄西林对表皮葡萄球菌的抗菌作用.利用二倍稀释法、微量棋盘稀释法、时间-杀菌曲线评估法对8株临床分离的表皮葡萄球菌进行药物敏感性测定.结果表明，盐酸小檗碱、苦参碱、氨苄西林单药对表皮葡萄球菌的最小抑菌质量浓度分别为0.8-3.1μg/mL、12.5 mg/mL 和0.5-16.0μg/mL.盐酸小檗碱联合氨苄西林作用于8株分离株后，盐酸小檗碱和氨苄西林的最小抑菌质量浓度分别下降了88%-94%和75%，抑菌浓度指数为0.187-0.498；苦参碱联合氨苄西林作用于8株分离株后，苦参碱和氨苄西林的最小抑菌质量浓度分别下降了80%和75%-94%，抑菌质量浓度指数为0.188-0.450.2种生物碱联合氨苄西林作用于表皮葡萄球菌的时间-杀菌曲线显示，菌落减少量大于等于2 lg N.盐酸小檗碱、苦参碱与氨苄西林联合作用表皮葡萄球菌均具有抗菌协同作用.

海藻糖对人脑型肌酸激酶热变性的保护作用

肌酸激酶(creatine kinase,CK)是研究蛋白质折叠和稳定性的一个理想的模型蛋白。热失活研究结果显示海藻糖能有效防止人脑型肌酸激酶(human brain-type creatine kinase,hBBCK)的热失活和热变性。1.0mol/L海藻糖使hBBCK热失活的半失活温度(Tm)升高4.6℃,活化能由原来的29.7kJ/mol升高到41.1kJ/mol。内源荧光光谱研究结果显示在海藻糖浓度分别为0、0.6、0.8和1.2mol/L时,hBBCK热变性的表观转变温度(T1/2)相应的从43.0℃上升到46.5、47.7和49.9℃。内源荧光和ANS外源荧光光谱研究结果表明海藻糖的疏水作用可能对hBBCK的热稳定性起了重要作用。hBBCK复性动力学试验结果表明海藻糖能有效抑制hBBCK复性过程中聚集体的形成。

谷氨酰胺对阉割后断奶仔猪生长性能、血液参数及免疫应答的影响

本研究通过两个试验探讨了日粮添加谷氨酰胺对断奶仔猪去势后生长性能、血浆参数及脂多糖诱导的免疫应答的影响。在试验1中,48只断奶仔猪分别饲喂添加基础日粮和含有2%谷氨酰胺的日粮,共进行25d饲养试验。在试验2中,16只断奶仔猪在断奶后第14天注射了大肠杆菌K88+脂多糖。结果表明,在断奶后第25天,谷氨酰胺组体重显著高于对照组(P <0.05),同时谷氨酰胺组较对照组显著提高了15~25d和1~25d断奶仔猪的饲料效率(P <0.05)。与对照组相比,谷氨酰胺组显著提高了空肠和回肠肌层厚度(P <0.05)。在断奶后25d,谷氨酰胺组血浆碱性磷酸酶活性显著高于对照组(P <0.05)。在LPS刺激前的断奶后第14天,谷氨酰胺组较对照组显著降低了血浆促肾上腺皮质激素和皮质醇浓度(P <0.05)。当猪接受LPS刺激时,血浆促肾上腺皮质激素和皮质醇水平显著升高(P <0.05)。LPS刺激后,对照组直肠温度显著高于处理组(P <0.05)。断奶后第14天,LPS刺激前或后谷氨酰胺组血浆IgG浓度均显著高于对照组(P <0.05)。结论 :日粮中添加2%谷氨酰胺能缓解断奶仔猪去势相关的应激状态和炎症反应,提高仔猪免疫和生长、发育。

布鲁氏菌S19毒力基因BvfA的原核表达及生物信息学分析

试验旨在对布鲁氏菌S19毒力因子A(BvfA)基因进行克隆及原核表达,并对其编码的BvfA蛋白结构进行生物信息学分析。登录GenBank下载布鲁氏菌S19的1号染色体(登录号:CP030751.1),根据文献报道的布鲁氏菌S19 BvfA基因的位置和BvfA蛋白的分子质量,在NCBI的ORF Finder中预测编码BvfA蛋白的开放阅读框(ORF),根据ORF预测的BvfA基因设计扩增BvfA基因的引物,克隆该序列并连接到表达载体pET-32a(+)上,构建重组质粒pET-32a(+)-BvfA,并诱导其在大肠杆菌BL21(Ril)感受态细胞中表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blotting验证,并用生物信息学方法对BvfA蛋白结构进行在线预测。结果显示,BvfA基因ORF全长为336 bp,表达纯化得到分子质量为11 ku的分泌型BvfA蛋白;生物信息学分析显示,BvfA蛋白属于不稳定的亲水性蛋白,无跨膜结构,第1-28位氨基酸处存在信号肽区域,BvfA蛋白55.6%定位于细胞外,有12个可能的磷酸化位点,无O-糖基化位点,BvfA蛋白二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成。以上结果可为后续研究BvfA蛋白在布鲁氏菌中的致病机制及寻找布鲁氏菌病新的治疗靶点提供一定的参考。

防御素的结构与功能及其抗菌机制

防御素作为广泛分布于动植物和微生物体内的一类抗菌肽,在抵抗感染性病原体的先天免疫防御中发挥着重要作用。许多防御素能够形成保守的由3条β-链组成的反平行β-折叠片核心结构。分子内二硫键维持该三级结构的稳定性和活性。植物、真菌和无脊椎动物防御素形成相同的CSαβ模体结构。防御素能够通过膜透化破坏膜屏障、直接靶向脂质Ⅱ抑制细胞壁生物合成、中和分泌的毒素来减少细菌感染以及在细菌周围形成“纳米网”捕获细菌等多种抗菌机制杀死或抑制细菌生长。防御素在先天免疫中的生物学功能、结构和活性的关系、作用机制和治疗潜力仍然是目前研究的热点。论文对几种不同来源防御素的结构,防御素结构与功能的关系以及防御素抗菌机制的研究进展进行了综述,以期为解决临床耐药问题提供参考。

广西工业现代化现状与加入WTO后的发展对策

为了民族的独立和国家的富强,我国从1953年起开始进行有计划的大规模的经济建设,实施了第一个五年计划(1953—1957),接着持续实行了9个五年计划。因此,用了将近半个世纪的时间,不仅改变了旧中国“一穷二白”的落后面貌,并且为我国建成了一个独立的。

临床耐药性表皮葡萄球菌整合子分子检测分析

目的了解医院临床耐药性表皮葡萄球菌整合子流行现状,以提高治疗效果。方法对2014年1月-2015年1月的18株临床耐药性表皮葡萄球菌进行回顾性分析,采用PCR方法利用特异性引物进行整合子筛查和分类,用PCR法扩增整合子的可变区,联合测序技术分析整合子携带的耐药基因,分析本地区基因盒的种类。结果 18株临床耐药性表皮葡萄球菌均检出整合子基因,检出率为100%;对整合子阳性菌株整合子进行测序分析,发现18株均为Ⅰ类整合子,对基因盒阳性菌株测序分析显示,基因盒排列为dfr A1+orf C。结论医院感染耐药性表皮葡萄球菌中的整合子主要为Ⅰ类整合子,耐药性表皮葡萄球菌整合子主要携带的是二氢叶酸还原酶耐药基因。

苦豆子碱对耐多药大肠杆菌AcrAB-ToLC蛋白表达量影响

本文通过微量肉汤稀释法筛选出了2株耐环丙沙星(CIP)、头孢噻肟(CTX)、阿米卡星(AN)、氨苄西林(AM)药物的多重耐药性大肠杆菌,测定了苦豆子碱对大肠埃希菌多重耐药菌株的MIC值为12.5mg/mL,MH肉汤稀释棋盘式法测定环丙沙星联合苦豆子碱、CCCP MIC值,通过计算部分抑菌浓度指数判断环丙沙星联合苦豆子碱呈协同作用,优化试验确定最适宜的逆转条件对耐药性大肠埃希菌进行逆转,对编码外排泵系统中AcrA、AcrB、AcrR、ToLC蛋白基因进行克隆、测序,同时应用实时定量PCR检测苦豆子碱对多重耐药菌株作用前后AcrA、AcrB、AcrR、ToLC蛋白的mRNA表达量影响。数据分析发现作用前后编码大肠杆菌外排泵系统AcrA、AcrB、AcrR、ToLC蛋白基因碱基序列未发生变化,但苦豆子碱作用后外排泵系统中AcrA、AcrB蛋白mRNA表达量下降,负调控蛋白AcrR mRNA表达量上升。苦豆子碱从整体上可以抑制耐多药大肠埃希氏菌AcrAB-ToLC的蛋白mRNA表达量,使大肠杆菌多药外排泵AcrAB-ToLC的蛋白mRNA表达量下降,从而恢复大肠杆菌对抗生素的相对敏感性。实验结果为深入研究苦豆子碱逆转耐药性大肠杆菌其它机制提供了依据和参考.

pEASY-E1-Int1表达载体的点突变改造与整合酶的表达分析

整合子—基因盒系统(Integron-gene cassette system)能使耐药基因在细菌种内和种间快速传播。在整合子—基因盒系统中起关键作用的是整合酶,本研究的目的在于克隆与NCBI公布的整合酶DNA序列完全一致的序列,并进一步表达纯化整合酶。采用PCR技术点突变改造pEASY-E1-Int1表达载体上的目的基因整合酶基因,共含5个突变位点,测序比对后,再连接与pEASY-E1 expression表达载体上,转化到BL21(DE3)感受态细胞中,不同浓度IPTG诱导优化表达,经聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting检测分析,结果得到表达产物分子量为33 kD与Ⅰ类整合子整合酶分子量一致的整合酶。本研究为下一步比较野生型和耐药性大肠杆菌整合酶活性提供基础指导。

耐药性大肠杆菌整合子整合酶的克隆与表达

为获得纯化的大肠杆菌Ⅰ类整合子整合酶,采用PCR技术扩增目的基因,将目的基因克隆到pEASY-T1载体上测序,测序结果与NCBI上公布的耐药性大肠杆菌Ⅰ类整合子整合酶基因完全一致后,再将目的基因克隆到表达载体pEASY-E1 Expression上,将表达质粒载体转化于rosetta感受态细胞中诱导表达,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western-blot)检测分析。结果表明:表达产物分子量为33 ku,与耐药性大肠杆菌Ⅰ类整合子整合酶分子量一致,为进一步测定酶的活性提供物质基础。