SPAG6基因RNAi慢病毒载体的构建及其对SKM-1细胞凋亡的影响

目的构建SPAG6-shRNA慢病毒载体靶向沉默SPAG6基因,探讨SPAG6基因沉默对人骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)细胞株SKM-1细胞增殖及凋亡的影响。方法设计并构建3条针对SPAG6基因的shRNA质粒表达载体,共转染293T细胞后得到可表达SPAG6基因RNAi的慢病毒载体。转染SKM-1细胞,利用流式细胞术检测转染效率,qRT-PCR及Western blot验证SPAG6基因干扰效果,筛选最佳靶点。CCK-8法检测SPAG6基因沉默对SKM-1细胞生长的影响,流式细胞术检测细胞凋亡。结果成功构建SPAG6-shRNA慢病毒载体,流式细胞术检测转染效率均在60%以上。qRT-PCR及Western blot检测结果显示SPAG6-shRNA3慢病毒载体敲除效率最高,为最佳靶点。SPAG6基因干扰后,干扰组SKM-1细胞的增殖明显受抑,抑制率为(60.18±0.37)%,与阴性对照组相比差别有统计学意义(P<0.05)。干扰组SKM-1细胞凋亡率为(16.32±5.80)%,显著高于阴性对照组[(4.28±0.88)%,P=0.024]及空白对照组[(3.08±1.50)%,P=0.019]。结论 SPAG6-shRNA慢病毒载体能有效降低SPAG6基因表达水平,抑制SKM-1细胞增殖并促进其凋亡。

靶向抑制DNAJC1基因对多发性骨髓瘤细胞凋亡和增殖的影响

目的研究DNAJC1基因对多发性骨髓瘤细胞增殖及凋亡的影响,初步探讨其作用机制。方法将DNAJC1-siRNA及阴性对照siRNA转染人多发性骨髓瘤细胞株U266,利用RT-qPCR及Western blot验证DNAJC1基因干扰效果,CCK-8检测DNAJC1基因对U266细胞增殖的影响,流式细胞仪检测其对细胞凋亡的影响。RT-qPCR及Western blot检测U266细胞中PTEN mRNA及蛋白表达。结果干扰组DNAJC1基因mRNA及蛋白表达明显降低,U266细胞的增殖明显受抑,抑制率为(58.95±8.13)%,与阴性siRNA组相比差异有统计学意义(P<0.05)。干扰组细胞凋亡率为(44.95±6.06)%,明显高于阴性siRNA组[(3.91±0.38)%]及对照组[(3.97±0.43)%,P<0.05]。与阴性siRNA组相比,干扰组PTEN的mRNA及蛋白表达明显升高(P<0.05)。结论靶向抑制DNAJC1基因可促进多发性骨髓瘤细胞的凋亡,抑制其增殖,这种作用可能是通过上调PTEN水平来实现的。

CD138免疫磁珠分选结合荧光原位杂交技术在多发性骨髓瘤中的应用

目的:比较未经分选直接进行荧光原位杂交(D-FISH)检测和CD138免疫磁珠分选结合荧光原位杂交(MACS-FISH)检测对多发性骨髓瘤(MM)患者细胞遗传学分析的影响。方法:回顾性分析229例初发MM患者的FISH检测结果,一组为140例采用D-FISH法,另一组为89例采用MACS-FISH法,设计探针组合为P53、D13S319、RB1、1q21和IgH,比较两组间细胞遗传学检测结果。结果:D-FISH组遗传学异常总检出率为52.9%,MACS-FISH组总检出率为79.8%,两组间的细胞遗传学异常检出率比较存在显著性差异(P=0.020);两组中检出率最高的细胞遗传学异常基因分别为1q21和IgH,检出率最低的为P53;两组间P53阳性细胞率比较无显著性差异,而D13S319、RB1、1q21和IgH阳性细胞率比较均存在显著性差异(P=0.0002,P<0.0001,P=0.0033,P=0.0032)。D-FISH组骨髓细胞形态学检测浆细胞比例与遗传学异常检出率无显著相关性,而流式细胞术检测浆细胞比例与遗传学异常检出率存在相关性(r=0.364)。MACS-FISH组骨髓细胞形态学和流式细胞术检测浆细胞比例与5种基因的检出率及阳性细胞率均无相关性。骨髓细胞形态学与流式细胞术的浆细胞比例检测结果存在显著性差异(P<0.0001)。结论:CD138免疫磁珠分选技术结合FISH能显著提高MM细胞遗传学异常的检出率。

探讨阿奇霉素联合红霉素治疗小儿支原体肺炎的临床效果

探讨阿奇霉素联合红霉素治疗小儿支原体肺炎的临床效果。方法:我院74例2017.1至2018.6小儿支原体肺炎患者。随机分组,单纯组采取阿奇霉素治疗,混合治疗组则采取阿奇霉素+红霉素治疗。比较两组疾病疗效;咳嗽症状消失、退热时间以及胸部x线检查正常时间;治疗前后患者炎性指标、肺部功能;副作用。结果:混合治疗组疾病疗效、咳嗽症状消失、退热时间以及胸部x线检查正常时间、炎性指标、肺部功能相比较单纯组更好,P<0.05。混合治疗组和单纯组副作用相似,P>0.05。结论:阿奇霉素+红霉素治疗小儿支原体肺炎效果好。

小鼠来源调节性T细胞的体外扩增培养及鉴定

目的建立小鼠来源调节性T细胞(Tregs)体外扩增培养方法,并检测扩增细胞的表型及体外免疫抑制功能,为Tregs应用于临床免疫治疗提供实验基础。方法利用免疫磁珠分离(MACS)方法从BALB/c小鼠脾脏中分选出CD4+T细胞,加入anti-CD3/CD28抗体、100 U/ml白细胞介素-2(IL-2)和5 ng/ml重组人转化生长因子β(rhTGF-β)体外扩增5 d。流式细胞术检测扩增后Tregs纯度及免疫抑制功能,台盼蓝染色法测定扩增后Tregs的数量和活性。结果扩增5 d后Tregs数目约为新鲜分选CD4^+T细胞的20倍,细胞活性为(93±4)%。扩增得到的Tregs纯度为(79.1±1.5)%且具有免疫抑制功能。结论本实验方法可以大量扩增出高纯度且具有免疫抑制功能的Tregs,解决了Tregs数目少的问题,有利于进一步的免疫研究和治疗。