果蔬酵素发酵过程中的染菌风险分析及预防策略研究

针对果蔬酵素在发酵过程中发生的染菌现象,采用风险分析的方法制定了预防策略。通过对染菌种类分析得知:常见的染菌类型为霉菌和酵母菌;通过系统图对发酵前、菌种扩培过程和酵素发酵过程的3个阶段从人员、机器、物料、方法和环境5个方面进行了系统分析,共找出了7个关键染菌风险点。针对这些风险点,详细分析了其产生原因,并提出了相应的预防策略。对策实施后,经过3年多的果蔬酵素发酵生产观察,未发生产品染菌现象,预防对策取得了良好的效果,同时取得了显著的经济效益和社会效益。

棕榈科植物叶斑病病原菌的生物学特性及药剂筛选试验

对引起银海枣(Phoenix sylvestris)、加拿利海枣(P.canariensis)、酒瓶椰子(Hyophorbe lagenicaulis)和棍棒椰子(H.verschaffeltii)叶斑病的病原真菌拟盘多毛胞(Pestalotiopsis palmarum)开展了生物学特性研究和防治药剂筛选。试验结果表明,该菌的最适生长温度为20～25℃;12 h光暗交替有利于子座的形成;菌丝生长最佳碳源为葡萄糖,最佳氮源为蛋白胨;甲基托布津、代森锰锌、多菌灵、扑海因、腈菌唑等对该菌的菌丝体生长均有较强的抑制效果,尤其以50%扑海因悬浮剂对其有较好的抑制效果,其EC50值为0.5625 mg/mL。

利用16S rDNA结合gyrA和gyrB基因对生防芽孢杆菌R31的快速鉴定

克隆16S rDNA、DNA促旋酶A亚基编码基因gyrA和B亚基编码基因gyrB对分离自石斛兰(Dendrobiumsp.)叶片的广谱抗真菌生防芽孢杆菌R31进行鉴定。首先通过生理生化测定和克隆16S rDNA序列,分析显示其属于芽孢杆菌属(Bacillus),但不能准确鉴定到种;然后分别利用克隆的gyrA基因和gyrB基因以及其BLAST分析结果构建系统发育树,最终将该菌株确定为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。结果显示利用16S rDNA与gyrA基因组合可以快速鉴定枯草芽孢杆菌,利用16S rDNA与gyrB基因组合可以快速鉴定枯草芽孢杆菌及其近缘种。

香蕉枯萎病菌菌株致病力分化及其原因研究

以田间表现出枯萎病症状的香蕉和粉蕉组织中分离获得的13株尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)为试验材料,分别测定了不同菌株对香蕉(巴西蕉)和粉蕉(广粉一号)的致病力以及在不同培养液中产生的细胞壁降解酶的活性和毒素含量。结果表明:不同菌株对香蕉和粉蕉的致病力存在明显差异;相关性分析显示,不同菌株产细胞降解酶活性与相应菌株侵染引起的寄主病情指数无相关性,产镰刀菌酸的含量与寄主病情指数呈极显著正相关(r=0.9326)。认为香蕉枯萎病菌菌株间产镰刀菌酸能力的不同是导致其致病力出现分化的主要原因之一。

枯草芽孢杆菌TR21对香蕉抗病相关酶活的诱导作用

为筛选能显著诱导香蕉抗病相关酶活变化的枯草芽孢杆菌TR21(Bacillus subtilis)发酵液组分,并探讨其诱导香蕉抗病性机理,选择多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)作为植物抗病性反应指标,采用灌根接种法,研究1株在大田对香蕉枯萎病具有良好防效的枯草芽孢杆菌TR21发酵液不同组分对香蕉根系内3种酶活性的影响。结果表明,接种TR21发酵液、菌体、上清和NB培养基后,香蕉根系内PPO、POD和PAL活性均比无菌水对照高,且都出现2次高峰,PPO、POD活性峰在接种后第3天和第7天出现,PAL活性峰则在接种后1天和5天时出现。比较不同组分接种处理诱导产生的酶活性强弱发现,接种TR21发酵液、菌体的3种酶活性均明显高于接种上清和NB的处理。可以判断TR21发酵液中主要有效诱导组分为菌体。灌根法接种TR21菌体后测定香蕉叶片中3种抗病酶的活性表明,菌体处理后叶片中PPO、POD和PAL活性均显著高于接种无菌水的对照,推测诱导系统抗性可能是TR21菌株防治香蕉枯萎病的机制之一。

枯草芽孢杆菌TR21在香蕉体内及根际的定殖动态

为了解不同方式接种下枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TR21在香蕉体内及根际的定殖情况,采用伤根、灌根和叶腋接种法,研究了TR21标记菌株在香蕉体内、根表和根际土壤中的定殖动态。结果表明,采用伤根和灌根法接种,根内最大定殖菌量分别为4.18×103cfu/g、2.28×103cfu/g,接种后1天,球茎中菌量分别为3.33×106cfu/g、6.5×102cfu/g,接种后15天,根表菌量分别为6.18×103cfu/g、5.53×103cfu/g,根际土壤中菌量分别为1.13×104cfu/g、1.04×104cfu/g;2种接种方法中,标记菌株在香蕉体内及根际的定殖动态总体呈下降趋势。采用叶腋法接种,标记菌株仅能在叶片中定殖,其定殖动态表现为"由升到降"趋势。因此,3种方式接种后TR21菌株均能够在香蕉体内定殖和传导,且在香蕉根表和根际土壤中有较好的定殖能力。

枯草芽孢杆菌TR21对香蕉抗病相关基因表达的诱导作用

广谱抗真菌枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis菌株TR21在温室和大田对香蕉枯萎病具有较好的防效,其机制已证明与诱导香蕉产生系统抗性有关。本文以巴西蕉(Musa AAA Cavendish subgroup cv.Brazil)为材料,利用半定量RT-PCR法,以香蕉25S rRNA基因为内标,研究灌根接种菌株TR21后对香蕉根系4种抗病相关基因表达的影响。结果表明,PAL、POD、PR-3和PR-1基因在接种后表达水平均表现上调趋势,但PAL和POD基因的表达增幅明显高于PR-3和PR-1基因。PAL和POD基因在接种后12 h表达量最高,与TR21在香蕉根部的定殖规律表现出一致性。系统诱导抗性是枯草芽孢杆菌TR21防治香蕉枯萎病的机制之一。

利用ITS1和ITS4通用引物扩增香蕉枯萎病菌核酸片段鉴定其生理小种

利用真菌核糖体rDNA区通用引物ITS1和ITS4,扩增采集自香蕉的13株镰刀菌包括18S rDNA部分序列、ITS1-5.8S-ITS2全部序列和28S rDNA部分序列的片段,通过BLAST序列比对分析,确定13株菌为尖孢镰刀菌[Fusarium oxysporum]。采用最大简约法,以层出镰刀菌[F.proliferatum(EU151490)]和茄病镰刀菌[F.solani(GQ376116)]为外群,将13株菌的序列与BLAST检索获得的尖镰孢古巴专化型(F.oxysporum f.sp.Cubense)相应序列构建了系统发育树。系统发育分析结果显示,13株菌与NCBI登录的4个尖镰孢古巴专化型菌株一起被分成3个亚群,亚群聚类结果与回接鉴定结果及文献报道的生理小种结果完全一致。

光照、氧气、pH和盐度对沼泽红假单胞菌2-8菌株生长和亚硝酸盐消除的影响

以1株具有亚硝酸盐消除能力的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)2-8菌株(简称2-8菌株)为材料,研究了不同光照和氧组合、pH、盐度对菌株生长和亚硝酸盐消除能力的影响。结果发现,光照厌氧条件最利于2-8菌株的生长,该条件下菌株亚硝酸盐消除能力最强,25h消除率达(91.33±1.27)%;菌株在pH7.0时生长和亚硝酸盐消除能力最强,25h亚硝酸盐消除率达到(95.58±4.34)%,在pH9.0以上和5.0以下时基本不生长;菌株在w(NaCl)为0和0.4%的培养基中生长和亚硝酸盐消除能力最强,在w(NaCl)为0.8%～2.0%的培养基中,生长和亚硝酸盐消除能力随w(NaCl)增高而减弱。测定的4个环境因子主要通过影响菌株的生长来影响其对亚硝酸盐的消除能力。

化学农药与芽孢杆菌M3、S11菌株对西芹黄萎病的防治效果

利用化学药剂与生防菌结合,对由尖孢镰刀菌芹菜专化型引起的西芹黄萎病进行综合防治研究。结果表明:苗期使用50%多菌灵可湿性粉剂(WP)、50%福美双·多菌灵WP(活根菌灭)或40%噁霉灵WP(噁霉敌)灌根均能显著消除育苗基质中的病原菌孢子,孢子下降率达99.00%以上;大田继续使用上述3种化学药剂或改用生防菌芽孢杆菌S11和M3,都能够显著降低西芹黄萎病发病率,防治效果最高为85.98%;其中持续单独使用50%多菌灵WP或苗期使用50%多菌灵WP、大田改用生防菌芽孢杆菌对西芹的生长没有不良影响。

西芹黄萎病防治药剂筛选和毒力测定

针对西芹黄萎病病原菌开展室内防治药剂筛选和药剂毒力测定。按照药剂最大推荐剂量从14种供试药剂中初筛出8种有效药剂,以进口多菌灵、菌哥、新世生、瓜果类太宝、太医最佳,对菌丝生长的抑制率达100%。8种药剂对病原菌菌丝生长的EC50依次为进口多菌灵(0.0063mg/ml)<太医(0.0073mg/ml)<活根菌灭(0.0077mg/ml)<枯萎灵(0.0079mg/ml)<瓜果类太保(0.0092mg/ml)<根腐宁(0.0103mg/ml)<新世生(0.0192mg/ml)<菌哥(0.0844mg/ml),进口多菌灵和活根菌灭对病原菌孢子萌发的EC50分别为1.50×10-4mg/ml和1.55×10-4mg/ml。

几种金属离子对沼泽红假单胞菌2-8生长和亚硝酸盐消除的影响

在培养基中添加一定浓度金属离子,研究了不同浓度铜离子(Cu2+)、镁离子(Mg2+)、锌离子(Zn2+)、铁离子(Fe3+)和锰离子(Mn2+)对沼泽红假单胞菌(Rhodopseudom onas palustris)2-8株生长和亚硝酸盐消除能力的影响。结果发现,1×10-7mol.L-1Cu2+刺激菌株生长和亚硝酸盐消除,1×10-4mol.L-1Cu2+抑制生长和亚硝酸盐消除,1×10-6mol.L-1和1×10-5mol.L-1的Cu2+抑制生长,但刺激亚硝酸盐消除;1×10-4mol.L-1Mg2+刺激菌株生长和亚硝酸盐消除;不同浓度Zn2+对菌体生长影响不显著,但浓度为1×10-6mol.L-1和1×10-7mol.L-1时刺激亚硝酸盐消除,浓度大于1×10-6mol.L-1时抑制亚硝酸盐消除;Fe3+促进生长,浓度越高生长越好,对菌株亚硝酸盐消除的影响则刚好相反;不同浓度Mn2+均抑制菌株生长,1×10-6～1×10-3mol.L-1Mn2+抑制亚硝酸盐消除。受测定的5个金属离子中除1×10-4mol.L-1Cu2+对菌株亚硝酸盐消除能力的抑制较强外,其他离子的抑制会随时间推移逐渐消失。

温度对西芹黄萎病病原菌生长和繁殖影响的研究

田间流行病学调查发现,气温高于25℃时,西芹黄萎病容易发生和流行。为了解温度对西芹黄萎病流行的影响,室内研究了不同温度下西芹黄萎病病原菌(Fusarium oxyporum f.sp.apii,FOA)的生长和繁殖情况。结果显示,PDA培养的FOA菌丝在25℃时生长最好;埋放在土壤中的FOA小型分生孢子在35℃时萌发率最高;利用土壤浸提液培养的FOA在25℃时菌丝生长速度显著高于其他温度,总孢子产量在30℃和35℃时显著高于其他温度,小型分生孢子在高于25℃时是最主要的孢子。温度高于25℃的确有利于FOA的生长、繁殖,有利于病害在田间流行,与流行病学调查的结果吻合。表明温度是影响西芹黄萎病流行暴发的关键生态因子。

香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种在几种培养基上的生长特性

测定10株分离自广东省不同香蕉种植区的香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种在不同培养基上的形态、生长速率和产孢能力的差异。结果显示,不同生理小种菌株在PDA、Komada改良培养基、粉蕉组织浸提液培养基和香蕉组织浸提液培养基上的形态、生长速率和产孢能力等特性差异不明显,不能依据这些特性区分1号和4号生理小种;但在康乃馨叶片琼脂(Carnation leaf agar,CLA)培养基上产生的孢子形态具有明显差异,4号生理小种的菌株产生典型的尖镰刀状大孢子,孢子多6个隔,长约(36.80±5.33)～(44.93±4.80)μm,宽约(3.40±0.20)～(4.27±0.25)μm,占总孢子数的比例较大,为(40.87±9.67)%～(62.50±7.84)%,而1号生理小种个体产生的大型孢子前端钝圆,弯曲程度低,多4个隔,孢子长约(22.31±3.89)～(25.01±6.16)μm,宽约(3.42±0.23)～(3.90±0.24)μm,占总孢子数的比例很小,为(2.55±1.95)%～(4.50±1.76)%。

香蕉枯萎病菌产毒条件的研究

从得病的香蕉茎组织中分离出病原真菌，经鉴定为古巴尖镰孢菌（Fusantanoxysporum f．sp．cubense）的4号小种。病菌在供试的液体培养基中可以产生对香蕉有毒性作用的毒素。不同培养液的产毒能力有明显的差异，6种培养液中以Richard培养液产毒能力最强。香蕉枯萎病菌产毒能力以温度为20℃，pH7—9，振荡培养（140次／min）条件下培养10-15d生物活性最强。高温高压灭菌30min的培养滤液，其毒素作用显著增强。

肠道共生细菌预发酵鸡粪对黑水虻生长发育的影响

以利用黑水虻Hermetia illucens L.肠道共生细菌不同菌株培养液预发酵的鸡粪为培养料,研究了添加不同菌株的发酵鸡粪对黑水虻幼虫生长发育的影响。结果表明,添加不同菌株的预发酵鸡粪能显著增加预蛹和蛹的重量,显著提高化蛹率并增加雌、雄成虫体长,缩短预蛹所需时间,但对幼虫存活率、成虫羽化率、成虫寿命没有显著影响。同时,不同菌株的作用效果有所不同。

香蕉枯萎病菌粗毒素对地衣芽胞杆菌生长和培养液上清蛋白组成的影响

本文研究了香蕉枯萎病菌4号生理小种湛江菌株(Foc 4-zj)产生的粗毒素对地衣芽胞杆菌R21菌株生长及其培养液中蛋白组成变化的影响。实验结果表明,Foc 4-zj的粗毒素能够抑制R21菌株的生长,缩短其生长周期;减少培养液上清蛋白含量以及改变蛋白质的种类;低剂量的粗毒素有利于拮抗蛋白的积累,而高剂量的粗毒素则相反。