凋亡抑制蛋白Survivin、bcl-2在非小细胞肺癌中的表达及意义

目的:探讨凋亡抑制蛋白Survivin、bcl-2蛋白在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达与不同临床病理特征的关系及二者在肺癌发生过程中可能存在的相关性。方法:采用免疫组化法的链霉菌抗生物素过氧化酶(S-P)法检测80例NSCLC组织和20例正常肺组织中Survivin、bcl-2蛋白表达情况。结果:非小细胞肺癌组织中Survivin、bcl-2蛋白阳性表达率分别为61.3%、50%,而在肺良性病变组织中阳性表达率分别为0%、10%,两者在两组中的表达均有显著性差异(P<0.05);Survivin蛋白在～期肺癌组织中阳性表达率72.0%显著高于I～II期肺癌组织的43.3%(P<0.05),bcl-2蛋白在鳞癌组的阳性表达率62.2%高于腺癌组的34.3%(P<0.05);Survivin、bcl-2蛋白在肺癌组织中的表达呈正相关关系。结论:Survivin蛋白表达与肺癌的TNM分期密切相关,Survivin、bcl-2可以作为判断病情和评价预后的指标。

非小细胞肺癌组织中PTEN、P53蛋白的表达

目的:探讨非小细胞肺癌(NSCLC)组织中PTEN、P53蛋白的表达及意义。方法:采用免疫组化方法检测75例NSCLC组织(鳞癌50例,腺癌25例;高分化18例,中分化34例,低分化23例;按临床TNM分期:Ⅰ+Ⅱ期50例,Ⅲ+Ⅳ期25例;有淋巴结转移45例,无淋巴结转移30例)和20例正常肺组织中PTEN、P53蛋白表达情况,分析二者在组织学分型、分化程度、临床分期和淋巴结转移方面表达差异以及相关性。结果:①肺癌标本中PTEN、P53的阳性表达率分别是48%(36/75)、53.3%(40/75),正常肺组织标本中阳性表达率分别是95%(19/20)、0%(0/20)。②二者在肺癌组织的阳性表达均未呈现组织学分型(鳞癌、腺癌)差异(P>0.05);PTEN在高、中分化组肺癌组织中的表达高于低分化组(P<0.05),P53在不同分化组间的表达差异无统计学意义(P>0.05);PTEN在Ⅰ～Ⅱ、无淋巴结转移标本中的表达分别高于Ⅲ～Ⅳ组和淋巴结转移组,P53在Ⅰ～Ⅱ、无淋巴结转移标本的表达分别低于Ⅲ～Ⅳ组和淋巴结转移组;③PTEN、P53在肺癌组织中的表达呈负相关(rs=-0.343,P<0.05)。结论:PTEN、P53可以作为肺癌预后的评价指标,二者在肺癌组织中表达可能相互拮抗。

七年制医学生组织学胚胎学双语教学的探讨

随着我国医学教育事业的发展和国际间医学交流的深入，医学界对高层次医学人才的需求愈加迫切。现在大部分医学院校已开始招收本硕连读的七年制医学生，对他们的医学课程讲授也提出更高的要求，部分院校开展了以英语和汉语相结合的双语教学（bilingualeducation）。即在教学过程中，使用两种语言进行课堂活动。旨在使学生在掌握专业知识的同时，熟知英语专业词汇和提高英语表达交流能力。为他们以后更好地融入国际医学交流环境打下坚实的基础。笔者已从事医学生七年制的双语教学若干年，总结了几点对该教学模式的认识和体会。

混合血清孵育的肺腺癌组织双向蛋白印迹图谱的建立

目的:建立混合血清孵育的肺腺癌组织双向蛋白印迹图谱。方法:收集2例肺腺癌患者的手术标本,提取癌组织可溶性总蛋白并双向凝胶电泳分离,将蛋白转移到硝酸纤维素膜上,然后分别与4例肺腺癌患者的混合血清和4例良性肺部疾病患者(对照)的混合血清孵育2 h,再加入二抗羊抗人IgG反应2 h,DAB显色。结果:分别建立了肺腺癌混合血清和对照混合血清孵育的肺腺癌组织双向蛋白印迹图谱,两个图谱之间存在明显差异。结论:利用混合血清孵育的肺腺癌组织总蛋白能建立良好的双向蛋白印迹图谱,这为进一步鉴定肺腺癌肿瘤相关抗原奠定了基础。

COX-2在非小细胞肺癌中的表达及与血管生成的关系

目的探讨COX-2蛋白在不同临床病理特征非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达情况及其与肿瘤微血管密度(MVD)间的关系。方法采用免疫组化法的链霉菌抗生物素过氧化酶(S-P)法检测85例NSCLC组织和20例正常肺组织中COX-2、CD34表达情况。结果NSCLC组织中COX-2阳性表达率56.5%,显著高于肺良性病变组织中的阳性表达率5.0%(P<0.05);在腺癌组织中阳性表达率(75.0%)显著高于鳞癌组织中阳性表达率(40.0%)(P<0.05);在高、中、低分化鳞癌组织中阳性表达率分别为18.8%、35.7%、66.7%;在高、低分化腺癌组织中阳性表达率分别为58.8%、87.0%,差异均有统计学意义(P<0.05);在淋巴结转移组的肺癌组织中阳性表达率(70.0%)显著高于无淋巴结转移组中的阳性表达率(37.1%)(P<0.05);COX-2阳性组MVD值(50.44±9.09)显著高于COX-2阴性组MVD值(34.60±7.24)(P<0.05);经直线相关分析,两者呈正相关(r=0.876,P<0.01)。结论COX-2表达与肺癌分化程度密切相关,揭示了COX-2可以作为判断病情和评价预后的指标。COX-2表达与MVD呈正相关,推测其可能具有促进肿瘤血管生成的作用。

非小细胞肺癌中PTEN与微血管生成的检测

目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)组织中PTEN的表达与肿瘤微血管生成的关系。方法采用免疫组化SP法分别检测75例肺癌组织和20例正常肺组织PTEN蛋白情况,以及不同PTEN表达组的肺癌组织中微血管密度(MVD)值的变化。结果肺癌组织中PTEN的阳性表达率为48%(36/75),低于其在正常肺组织中的阳性表达率95%(19/20)(P<0.05);PTEN阳性组MVD值34.53±10.26低于PTEN阴性组的MVD值49.40±12.54(P<0.05)。结论肺癌中PTEN表达的减低可能促使微血管密度增加,导致肺癌预后不良。

与肺癌源性HSP70特异性结合单链融合抗体的筛选与序列分析

目的从人源性肺癌噬菌体单链抗体库中筛选与肺癌源性HSP70特异性结合的融合抗体。方法以肺癌源性的HSP70为抗原,对人源性肺癌噬菌体单链抗体库中经四轮筛选,单克隆噬菌体抗体与抗原HSP70结合经ELISA检测筛选出阳性菌株,再经PCR进一步鉴定,确定含有单链抗体基因的克隆并测序,测序结果通过GeneBank比对进行同源性分析。结果获得了1个特异性强的阳性噬菌体克隆。经DNA测序后,在Genebank中与人的免疫球蛋白库进行比对,确定为单链抗体片段。结论从人源性肺癌噬菌体单链抗体库中筛选到与HSP70特异性结合的具有功能活性的单链融合抗体,为进一步的HSP70可溶性抗体的制备以及以可溶性HSP70抗体为载体的药物导向抗肿瘤治疗奠定了基础。

肺腺癌血清肿瘤标志物的筛选与鉴定

目的应用蛋白质组学方法筛选肺腺癌患者血清中的肿瘤标志物。方法收集8例肺腺癌患者及8例正常人血清,剔除血清中白蛋白干扰后,得到血清可溶性总蛋白并采用双向电泳方法分离,获得血清蛋白质的双向电泳图谱,经PDQuest7.1凝胶图像软件分析找出表达差异的蛋白点,经基质辅助电离解析飞行时间质谱检测获得待测蛋白的肽质量指纹图谱,通过搜寻蛋白质数据库鉴定出肺腺癌血清中候选的肿瘤相关蛋白。结果建立了肺腺癌患者及正常人血清蛋白质表达谱。经软件匹配分析,共筛选出24个差异的蛋白点,从中选出差异显著的7个蛋白点进行质谱分析,经数据库查询分析,成功的鉴定出5种蛋白质:凝聚素、触珠蛋白、血清淀粉样蛋白A、血清白蛋白A链、纤维胶凝蛋白3。结论本研究建立了人肺腺癌患者及正常人血清的双向电泳图谱;鉴定出了若干肺癌相关蛋白质,为进一步寻找肺癌蛋白标志物奠定了基础。

深圳市HIV-1流行毒株膜蛋白基因C2-V3区序列测定及亚型分析

目的对深圳市HIV-I流行毒株亚型监测分析。方法应用巢式PCR方法对26份1998年10月-1999年8月采集的深圳市HIV感染者的外周静脉血淋巴细胞样品的基因进行扩增,获得了HIV-1膜蛋白基因(env)的核进片段,并对其C2-V3区及邻近350-450个核苷酸序列进行了测定和分析。结果26份样品中,7份为B亚型、5份为C亚型、14份为E亚型。结论深圳地区人群中流行的HIV-1毒株归属于E、B、C三种亚型,尚未发现其它亚型。

肺癌相关蛋白的筛选与鉴定

目的:应用蛋白质组学方法筛选肺癌相关蛋白,为阐明肺癌发生的分子机制和预后研究提供理论依据.方法:收集8例手术切除的新鲜肺癌组织及同一患者手术切缘的癌旁组织,提取可溶性总蛋白.应用等电聚焦(IEF)电泳和十二烷基磺酸钠聚丙烯酰凝胶电泳(SDS-PAGE)技术将可溶性总蛋白分离,得到肺癌的蛋白质组分析型双向电泳图谱,经PDQuest凝胶图像分析软件分析后找出差异蛋白点.胶内酶解差异表达的蛋白点,基质辅助电离解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)获得肽质量指纹图谱(PMF),搜寻蛋白质数据库,并运用生物信息学鉴定蛋白质,分析蛋白的生物学意义和生物学功能,作为肺癌标志物的候选蛋白.结果:分别将8例肺癌组织及配对的癌旁组织可溶性总蛋白经过重复3次双向电泳,建立了肺癌组织蛋白质表达谱.经PDQuest凝胶图像分析软件进行分析后,12个蛋白质斑点只在肺癌组织有表达;6个蛋白质斑点只在癌旁表达.对高丰度的肺癌特异表达的蛋白点进行鉴定,结果表明这些特异蛋白分别为钙粒蛋白B,Calgizzarin,载脂蛋白A-I,载脂蛋白E,Ras相关蛋白Rab-14,亲环素.结论:建立了人肺癌组织和癌旁组织的双向电泳图谱,为建立相应的蛋白质数据库提供了基础数据;鉴定了钙粒蛋白B等肺癌相关蛋白质,为进一步寻找肺癌蛋白标志物奠定了基础,对阐明肺癌发生的分子机制和预后研究有重要理论意义.

热化疗对肺部肿瘤细胞生长影响的研究

[目的]研究热化疗联合对肺部肿瘤细胞生长的影响。[方法]构建人谷胱甘肽硫转移酶P1(glutathione- s-transferase P1,GSTP1)基因的真核表达载体,转染人肺腺癌A549细胞,然后按临床常用剂量,用6．25、12．50、25．00、50．00、100．00、200．00μg/L紫杉醇处理转染和未转染的A549细胞,并联合43℃加热,用噻唑蓝比色法(MTT法)和流式细胞术(FCM)检测转染前后A549细胞在不同条件下的生长和细胞周期分布,并运用SPSS 11．5对数据进行统计分析。[结果]两种细胞在6．25、12．50、25．00、50．00、100．00μg/L浓度的紫杉醇作用下,未转染细胞增殖率低于转染细胞(P< 0．05)。43℃加热,两种细胞在6．25、12．50、25．00、50．00、100．00、200．00μg/L浓度的紫杉醇作用下,未转染细胞增殖率高于转染细胞(P<0．05);流式细胞仪检测两种细胞的生长周期,与未转染细胞相比,转染细胞的G0／G1期(53．30％与67．40％)和G2M期(8．82％与19．60％)延长,S期缩短(37．90％与13．00％),均P<0．05。[结论]热化疗联合治疗可以逆转肺部肿瘤细胞的耐药,为进一步研究预防肺癌发生及其与职业性肺癌的关系奠定了基础。

非小细胞肺癌组织中PTEN、P53蛋白及微血管密度检测

目的：检测非小细胞肺癌（NSCLC）组织中微血管密度（MVD）、PTEN、P53的表达。方法：采用免疫组化SP法分别检测75例NSCLC组织中PTEN、P53的表达及MVD。75例NSCLC患者中男55例，女20例；鳞癌50例．腺癌25例；高分化18例，中分化34例，低分化23例；Ⅰ＋Ⅱ期50例，Ⅲ＋Ⅳ期25例；有淋巴结转移45例，无淋巴—结转移。0例。结果：肺腺癌组织MVD高于鳞癌组织，Ⅲ-Ⅳ期肺癌组织中MVD高于Ⅰ-Ⅱ期肺癌组织，有淋巴结转移肺癌组织中MVD高于无淋巴结转移者（P均〈0．05）；PTEN阳性肺癌组织中MVD低于PTEN阴性者，P53阳性组肺癌组织中MVD高于P53阴性组（P均〈0．05）。结论：NSCLC组织中PTEN表达的减低、突变型P53表达的升高可促使新生血管生成，MVD增加，提示预后不良。

二硫苏糖醇诱导Eca109细胞凋亡及P38磷酸化检测

目的:检测二硫苏糖醇(DTT)诱导Eca109细胞凋亡及磷酸化P38(PP38)水平。方法:取对数生长期Eca109细胞分为3组:2mmol/L DTT处理组、PP38抑制剂SB203580孵育细胞2h后再加DTT处理组及对照组。应用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率;采用免疫组织化学技术检测P38的磷酸化水平。结果:DTT组、SB203580+DTT组及对照组的细胞凋亡率分别为16.8%、7.8%和3.1%。DTT组和DTT+SB203580组细胞凋亡率均高于对照组(P<0.01);与DTT组相比,SB203580+DTT组凋亡率下降(P<0.01)。DTT组PP38水平高于对照组(P<0.01)。结论:DTT可诱导人食管癌Eca109细胞凋亡,P38磷酸化起促进凋亡的作用。

留学生组织学与胚胎学教学需求调查与分析

随着中外医学交流的不断发展,我国医学高等教育日趋国际化[1].自1998年至今,我校已连续招收十余届医学留学生,且人数逐年攀升.如何保证留学生教学质量并进一步提高教学水平,是广大医学院校目前急需解决的问题.多年的教学积累证明只有充分重视学生的反馈意见,才能促进教学工作不断进步[2],基于此笔者进行了问卷调查,以充分了解当前医学留学生对＆lt;组织学与胚胎学＆gt;教学方法、教学质量等的认可情况,以及对开展某些重大教学改革的需求情况和教材选用情况等,为完善今后的教学工作提供科学依据.

心肌梗死后不同时间移植骨髓间充质干细胞对心脏功能修复的作用

目的:观察心肌梗死后不同时间点移植骨髓间充质干细胞对梗死心肌修复的影响,寻找细胞治疗的有效移植时间窗。方法:实验于2006-04/10在郑州大学基础医学院完成。①实验动物:清洁级6周龄雄性SD大鼠81只,1只用于获取骨髓间充质干细胞,剩余80只随机数字表法分为细胞移植组、培养液对照组,再按心肌梗死后1d及1,2,3周进行移植的时间各分为4个亚组,10只/组。②实验方法:获取、培养大鼠骨髓间充质干细胞,培养至第3代接近70%融合时,加入5-溴脱氧尿嘧啶体外标记,调整细胞密度为4×1010L-1备用。两组大鼠均结扎左冠状动脉前降支建立心肌梗死模型。细胞移植组各亚组按对应时间点在心肌梗死中央及四周移植骨髓间充质干细胞悬液50μL/点(2×106个),培养液对照组各亚组于相同部位移植L-DMEM培养液,50μL/点。③实验评估:移植前和移植3周后检测心功能;苏木精-伊红、免疫组织化学染色观察心肌梗死区组织及细胞变化。结果:共79只大鼠进入结果分析。①骨髓间充质干细胞的生长特点:刚分离的细胞为圆形。5d后有集落形成,细胞呈梭形、纺锤形或多角形,胞核较大。传代后细胞体积较原代细胞增大,生长速度加快。②心肌梗死后不同时间移植骨髓间充质干细胞的心功能比较:与移植前比较,移植3周后细胞移植组各亚组左室射血分数、短轴缩短率均有所改善(P<0.05),以心肌梗死后2周细胞移植组最为明显(P<0.01);培养液对照组各亚组左室射血分数、短轴缩短率均下降(P<0.05)。③梗死心肌组织学观察:细胞移植组心肌梗死区及周边可见核蓝色深染的细胞,排列整齐,梗死区瘢痕化减轻。④骨髓间充质干细胞在心肌组织中的分化:细胞移植组梗死心肌内可见大量BrdU标记阳性的骨髓间充质干细胞,胞核呈棕黄色,对心肌特异性肌钙蛋白T呈阳性表达。结论:心肌梗死后早期移植骨髓间充质干细胞能够改善心功能,以2周内进行细胞移植的效果较佳。

非小细胞肺癌中survivin蛋白的表达及其与p53表达的关系

目的探讨非小细胞肺癌组织中survivin蛋白的表达与临床病理特征的关系及其与p53表达的相关性。方法采用免疫组化的链霉菌抗生物素过氧化酶法(Streptavidin-Peroxidase,SP)检测80例NSCLC组织和20例正常肺组织中survivin、p53蛋白表达情况。结果80例非小细胞肺癌组织中sur-vivin蛋白阳性例数49例,表达率为61.3%,在肺良性病变组织中,未阳性表达,两组比较差异有显著性(P<0.05);在III^IV期肺癌组织中survivin蛋白阳性表达率显著高于I^II期肺癌组织(P<0.05),而与组织学分型、分化程度、淋巴结转移与否无关(P>0.05);survivin、突变型p53蛋白在肺癌组织中的表达呈正相关。结论survivin蛋白表达与肺癌的TNM分期密切相关,有可能成为判断病情和评价预后的指标,survivin有望成为肺癌诊断的肿瘤标志物及基因治疗的新靶点;survivin、突变型p53蛋白在肺癌组织的协同高表达可能促使肺癌病情的恶性发展。

非小细胞肺癌组织中RASSF_(1A)和p16基因启动子甲基化研究

目的:研究肺癌新型侯选抑癌基因Ras相关结构域家族基因1A(RASSF1A)和p16基因在非小细胞肺癌(NSCLC)中的甲基化情况,揭示两基因表达失活的机制,为NSCLC的基因诊断和治疗寻找新途径。方法:用甲基化特异性PCR(MSP)方法对96例NSCLC患者癌组织及相应的远癌正常肺组织中RASSF1A和p16基因启动子甲基化状态进行检测。结果:(1)96例NSCLC组织RASSF1A甲基化率48.96%,p16基因34.38%,96例远癌正常肺组织均未发现此两基因甲基化。(2)RASSF1A甲基化率鳞癌组(64.29%)高于腺癌组(37.04%,P<0.05);p16基因甲基化率50岁以上组(44.93%)高于50岁以下组(7.41%,P<0.05),鳞癌(61.90%)高于腺癌(12.96%,P<0.05),有淋巴结转移组(46.67%)高于无淋巴结转移组(13.89%,P<0.05)。(3)RASSF1A与p16基因启动子CPG岛甲基化呈正相关(r=0.256,P<0.05)。结论:RASSF1A和p16在NSCLC尤其是鳞癌中频繁甲基化,可能是两基因表达失活的主要原因。

重症肌无力胸腺组织蛋白质组双向电泳方法的建立

目的:建立和优化重症肌无力(MG)胸腺组织蛋白质组双向电泳技术方法。方法:提取MG患者(n=3)增生型胸腺组织蛋白,以固相pH梯度胶条做第一向等电聚焦电泳,SDS聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳为第二向。在以上过程中分别对蛋白提取、等电聚焦程序(A、B、C、D)和凝胶染色方法等各个实验环节进行控制和优化,利用PDQuest7.1.1软件分析获得的二维凝胶图像。结果:①采用一步法提取胸腺组织蛋白质,第一向等电聚焦采用7cmIPG胶条,聚焦程序选择B,硝酸银染色。3例标本重复4次,共获12幅二维凝胶图像。随机选取1例标本的2幅图像,利用软件对2幅中的蛋白点进行匹配,匹配率为82.1%;3份样品共12幅凝胶图像的对比,获得3个共同存在的标志蛋白点,相对分子质量和等电点分别为:A点(82700,7.0)、B点(50700,5.76)和C点(33300,5.02)。②进一步优化上述实验条件,选择1例标本,采用两步法提取胸腺组织蛋白质,选用17cmIPG胶条,聚焦采用程序D,考马斯亮蓝染色,获得的二维凝胶图像与一步法(其他条件相同)比较。一步法可检测到蛋白质点326个,两步法可检测到562个蛋白点。结论:①建立了MG胸腺组织蛋白质组提取的方法。采用两步法可以更有效地提取胸腺组织蛋白质组。②利用优化后的实验方法,获得了MG胸腺组织蛋白二维凝胶图像,为开展MG胸腺组织蛋白质组学研究打下了基础。

热休克蛋白70双向免疫印记鉴定及抗体制备

目的验证肺癌组织中热休克蛋白70(HSP 70)表达量,从肺癌组织中获得HSP 70并初步制备其人源性抗体,为进一步研究其生物功能和临床应用奠定基础。方法收集肺癌组织和癌旁组织标本,应用双向电泳-免疫印记方法验证HSP 70的表达量,经过亲和层析和离子交换层析方法获得肺癌组织中HSP 70作为抗原,经过四轮亲和-吸附-洗脱,从人源性肺癌噬菌体单链抗体库中初步筛选其抗体。结果双向电泳-免疫印记结果表明,肺癌组织HSP 70表达量高于癌旁组织。凝胶电泳和免疫印记结果表明,从肺癌组织中获得了人源性HSP 70,以此HSP 70作为抗原,初步筛选出了其抗体。结论人源性HSP 70及其人源性特异结合抗体的获得,为进一步研究其抗肺癌的临床应用提供了基础依据。