炎症应答中去泛素化酶圆柱瘤蛋白相互作用分子筛选和验证

目的筛选炎症应答中与去泛素化酶圆柱瘤蛋白(CYLD)相互作用分子,探究并验证CYLD和参与NF-κB信号通路调节的桥梁蛋白14-3-3家族分子之间是否在细胞内存在相互作用。方法通过免疫共沉淀(Co-IP)飞行质谱筛选可能与CYLD相互作用分子,在不同的刺激条件下诱导骨髓原代巨噬细胞向M1和M2极化,利用qRT-PCR、Western blotting技术检测CYLD及可能相互作用的候选分子14-3-3在巨噬细胞内的表达水平。结果CYLD抗体可以捕获14-3-3蛋白全部的7种亚型(β、γ、ε、η、ζ、δ、θ),提示CYLD很可能与14-3-3蛋白存在相互作用,选取质谱结果中得到特异性肽段最多的3种14-3-3亚型γ、ε、η(14-3-3γ/ε/η),检测结果显示在M0、M1、M2型巨噬细胞中CYLD和14-3-3γ/ε/η均有表达。构建了Myc-CYLD和Flag-14-3-3γ/ε/η真核过表达载体,用Flag抗体成功沉淀出CYLD蛋白,Co-IP结果提示CYLD和14-3-3γ/ε/η三种亚型均存在相互作用。免疫荧光实验显示CYLD和14-3-3在巨噬细胞内存在共定位现象。结论巨噬细胞炎症应答中CYLD和14-3-3γ/ε/η三种亚型可能存在物理上的相互作用。

PRL-3基因对胶质母细胞瘤替莫唑胺敏感性的影响

目的研究PRL-3基因在胶质母细胞瘤中的表达及其对胶质母细胞瘤替莫唑胺敏感性的影响。方法通过TCGA数据库分析PRL-3基因在胶质母细胞瘤及正常组织中表达情况,进一步选取空军军医大学第一附属医院诊治的15例胶质母细胞瘤患者术后肿瘤组织(原发性10例,复发性5例),采用免疫组织化学法检测PRL-3阳性细胞在胶质母细胞瘤中的表达情况。选取人胶质母细胞瘤LN229细胞系及替莫唑胺耐药的LN229/TMZ-R细胞系,采用qRT-PCR、Western blot检测PRL-3 mRNA及蛋白的表达情况。选取LN229、SHG44细胞系及对替莫唑胺不敏感的U87细胞系,分别设置正常组、对照组、空载质粒组、PRL-3过表达组、PRL-3下调组。比较正常组、空载质粒组、PRL-3过表达组、PRL-3下调组PRL-3 mRNA表达情况以验证PRL-3过表达及下调是否成功。然后将对照组、PRL-3过表达组、PRL-3下调组采用替莫唑胺(LN229、SHG44细胞系加入替莫唑胺100μmol/L,U87细胞系加入替莫唑胺500μmol/L)进行处理,正常组不处理,72 h后采用CCK-8法测定细胞活性。结果数据库分析显示,原发性胶质母细胞瘤中PRL-3表达高于正常组织,且随肿瘤级别增高而升高(P<0.05)。复发性胶质母细胞瘤组织中PRL-3阳性细胞免疫组织化学法评分高于原发性胶质母细胞瘤组织(P<0.05)。LN229/TMZ-R细胞系中PRL-3 mRNA表达高于LN229细胞系(P<0.05),PRL-3蛋白在LN229/TMZ-R细胞系中高表达。PRL-3过表达组PRL-3 mRNA高于正常组,PRL-3下调组PRL-3 mRNA低于正常组(P<0.05)。在LN229、SHG44、U87细胞系中,对照组细胞活性低于正常组,PRL-3过表达组细胞活性高于对照组,PRL-3下调组细胞活性低于对照组(P<0.05)。结论PRL-3基因低表达可以增强胶质母细胞瘤对替莫唑胺治疗的敏感性,有望成为协同替莫唑胺化疗的有益靶点。

lncRNA-H19通过促进成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)活性参与胶原蛋白诱导关节炎(CIA)小鼠滑膜炎症进展

目的探讨长链非编码RNA H19(lncRNA-H19)对成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)功能及对胶原蛋白诱导关节炎(CIA)小鼠模型的影响。方法分离并培养类风湿性关节炎(RA)患者FLS,利用过表达腺病毒和小干扰RNA(siRNA),分别上调和下调RA FLS的H19表达水平,通过5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)检测RA FLS增殖、Transwell^(TM)实验检测细胞侵袭、细胞划痕实验检测RA FLS迁移能力;建立小鼠CIA模型,关节局部注射H19短发夹RNA慢病毒(LV-sh-H19),通过测量足厚度、关节炎指数和HE染色评价疾病进展。结果H19促进FLS的增殖、侵袭和迁移能力;注射LV-sh-H19的模型小鼠踝关节结构良好,关节局部有较少免疫细胞浸润和滑膜增生,敲低H19能够缓解CIA小鼠的关节炎症。结论H19通过促进FLS活化参与CIA小鼠滑膜炎症和疾病进展。

衰老标记蛋白30介导四氢姜黄素抗心肌缺血再灌注损伤的机制研究

目的探讨衰老标记蛋白30(SMP30)在四氢姜黄素(THC)抗心肌缺血再灌注(MI/R)损伤中的作用。方法构建H9c2细胞缺氧/复氧模型和小鼠MI/R模型,利用腺病毒和短发夹RNA(shRNA),在细胞和动物水平下调心肌的SMP30的表达,通过CCK8细胞活力试剂盒、ANNEXIN V-FITC/PI凋亡试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)活性试剂盒、肌酸激酶同功酶(CK-MB)试剂盒、心脏超声等方法,评价细胞活性和心脏功能。结果敲低SMP30水平后,THC对H9c2细胞的保护作用被部分逆转,THC抗H/R诱发的H9c2细胞死亡能力被削弱;SMP30通过Bax/Blc2途径介导THC对H9c2细胞的保护;THC能够显著改善小鼠MI/R后心脏功能,敲低小鼠心脏SMP30水平后,THC的心脏保护作用被部分逆转。结论SMP30参与介导THC抗I/R诱发的心肌细胞凋亡。