意义未明单克隆免疫球蛋白病及多发性骨髓瘤患者微RNA-221和微RNA-222的表达

目的：探讨意义未明单克隆免疫球蛋白病（ MGUS ）、多发性骨髓瘤（MM）患者血清和浆细胞中微RNA-221（miR-221）和微RNA-222（miR-222）的表达水平及其作为MGUS、MM诊断和预测预后生物学指标的可能性。方法：收集2013年1月至2015年12月浙江大学医学院附属邵逸夫医院及浙江省立同德医院14例初诊MGUS患者、81例初诊及复发MM患者和10名健康对照者的血清及骨髓标本，其中骨髓标本用CD138磁珠分选浆细胞。用实时定量PCR检测血清和浆细胞中miR-221／222的表达量。采用Δct表示miR-221／222的相对表达量并比较组间差异。比较缓解组和难治组MM患者治疗前后血清miR-221表达水平的变化，并分析其与血清β2微球蛋白的相关性。结果：MGUS 患者和 MM 患者血清miR-221／222的表达量均较对照组高（均P＜0．01），而浆细胞miR-221／222的表达量均较对照组低（ P＜0．05或＜0．01）；MGUS与MM患者miR-221和miR-222表达量的差异在血清中或在浆细胞中均无统计学意义（均P＞0．05）。 miR-221和miR-222表达量在血清与浆细胞之间无相关性（r＝0．024和－0．127，均P＞0．05）；而血清和浆细胞 miR-221与 miR-222表达量之间均具有相关性（ r ＝0．534和0．552，均P＜0．01）。受试者工作特征（ ROC）曲线显示血清miR-221／222和浆细胞miR-221／222诊断MGUS、MM 的曲线下面积（ AUC ）分别为0．968和0．976、0．801和0．727。 MM患者不同M－蛋白类型之间血清miR-221的表达量差异无统计学意义（P＞0．05）。复发患者血清miR-221的表达量高于初诊患者（P＜0．01）。DS分期为Ⅲ期MM患者血清miR-221表达量高于MGUS及DS分期Ⅰ期和Ⅱ期MM患者（P＜0．01）。缓解组治疗后血清miR-221表达量低于治疗前（U＝51．5， P＜0．01），而难治组治疗前后血清miR-221表达量差异无统计学意义（U＝67．5， P＞0．05）。 MM患者血清β2微球蛋白水平与血清miR-221的表达量呈正相关（r＝0．524，P＜0．01）。结论：检测患者血清、浆细胞miR-221／222表达量有助于MGUS的早期诊断，也有助于MM的诊断及疗效观察。

迪康胶囊抗大鼠肝纤维化作用机制的实验研究

目的通过迪康胶囊治疗不同剂量二甲基亚硝胺(DMN)诱导的肝纤维化大鼠,分离星状细胞检测胞浆CollagenⅢ、αSMA、Smad3、Smad7mRNA表达的变化,以期了解其在抗肝纤维化作用中的分子机制,为其抗肝纤维化提供证据。方法Wistar雄性大鼠共50只,分为病理1组、2组,治疗1组、2组,正常对照组。分别以不同剂量诱导形成肝纤维化模型并用迪康胶囊治疗。6周后,处死大鼠,分离各组大鼠肝星状细胞,进行体外培养,采用RTPCR方法测定各组大鼠星状细胞中胞浆信号蛋白CollagenⅢ、αSMA、Smad3、Smad7的mRNA的表达,以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)做内参,琼脂糖电泳后照相读取灰度,以扩增片段/GAPDH的比值为mRNA的相对含量进行比较。结果两组病理组星状细胞CollagenⅢ、αSMA和Smad3mRNA与正常对照组相比表达均增加(P<0.01),两组病理组之间无统计学差异;而Smad3与正常组相比则无统计学差异。迪康胶囊治疗后,CollagenⅢ、αSMA和Smad3表达均下降(P<0.05),而Smad7表达则明显增加(P<0.05)。结论迪康胶囊缓解DMN诱导的大鼠肝纤维化程度,使其胶原表达减少,星状细胞αSMA的表达降低,使星状细胞胞浆信号蛋白Smad3的mRNA表达降低,Smad7mRNA表达升高,说明迪康胶囊对不同剂量DMN诱导的肝纤维化均有不同程度的抗纤维化作用。

新鲜血在自动化血沉分析仪TEST_(1EC)质量控制中的应用

目的建立一种使用新鲜全血完成自动化血沉分析仪TEST1EC的质量控制方法。方法EDTA K3抗凝标本用自动化血沉分析仪ALIFAX TEST1EC在4h内测定血沉,同时用改良魏氏法测定血沉。计算日积累平均值,制作Levey Jennings质控图。结果手工法与仪器法相关性良好(Y=0.822X±2.774,r=0.993)。以常规标本日积累均值及相应的标准差所作Levey Jennings质控图,每天的日积累均值落在均值附近的±2s范围内(x=19.80,s=3.07)。结论建立新鲜全血标本的TEST1EC仪器质控方法有利于开展自动化血沉仪的质控,而且价格低廉,是值得推广的质控方法。

大鼠BMP-7重组腺病毒构建及在肾小管上皮细胞中表达

目的:利用AdEasyTMsystem构建携带大鼠BMP-7基因的重组腺病毒,并鉴定其在原代肾小管上皮细胞中的表达。方法:将BMP-7全长序列分为46个片段分段合成,再采用PCR方法将合成的46个寡核苷酸片段拼接成BMP-7基因,并克隆到测序载体中测序鉴定。经NotI和HindⅢ双酶切后接入pShuttle-CMV穿梭载体,构建重组腺病毒的穿梭质粒pShuttle-BMP-7。EcoRI酶切重组pShuttle-BMP-7,与pAdEasyTMDNA电穿孔共转化BJ5183感受态菌,抽提重组AdBMP-7质粒,PacI酶切线性化重组质粒AdBMP-7后,转染Ad293细胞进行病毒包装和扩增,腺病毒荧光检测试剂盒测定其滴度。用AdBMP-7感染大鼠肾小管上皮细胞,以ELISA法和W estern-blot法检测BMP-7在大鼠肾小管上皮细胞中的表达。RT-PCR方法检测-αSMA mRNA的表达水平,以鉴定重组腺病毒AdBMP-7的生物学活性。结果:构建了BMP-7基因的重组腺病毒载体,并制备出高滴度重组腺病毒保存液。该重组腺病毒在体外能有效转染大鼠肾小管上皮细胞并高表达BMP-7蛋白,所表达的BMP-7蛋白能有效逆转由TGF-β1诱导的α-SMA表达增高。结论:成功地构建了携带大鼠BMP-7基因的重组腺病毒,并初步证实其具有一定的抗肾纤维化功能。

用酶联免疫吸附试验测定血浆组织纤溶酶原激活物

目的研究酶联免疫吸附试验 (EL ISA)法与发色底物法对照测定血浆组织纤溶酶原激活物 (t- PA)。方法分别用发色底物法和 EL ISA法对正常组 48例与脑梗死组 32例进行 t- PA测定。结果 EL ISA法的线性范围为 1.2 5～ 80μg/L ,平均回收率为 99.7%。用 EL ISA法测得血浆值分别为正常组 (9.5± 3.7)μg/L、脑梗死组(16 .1± 5 .3)μg/L (P<0 .0 1) ;用发色底物法测得分别正常组 (0 .47± 0 .13)× 10 - 3U /L、脑梗死组 (0 .82± 0 .2 3)×10 - 3 U/L(P<0 .0 1)。并以发色底物法为坐标轴 x,EL ISA法为坐标轴 y,作直线回归分析 ,求得回归公式 y=19.70 5 x+0 .3892 ,相关系数 r=0 .92 2 1,P<0 .0 0 1。 EL ISA法阳性率正常组为 3.1% ,脑梗死组为 6 8.8% ,底物发色法阳性率正常组为 9.4% ,脑梗死组为 5 9.4% ,但其差异无统计学意义。结论两种方法是可以相互补充 ,从不同角度测定 t- PA,EL ISA法测定方便、快捷 。

溶石颗粒剂对结石模型大鼠肾骨桥蛋白表达的影响

目的:通过测定用药前后肾脏骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的变化,来阐明民间验方溶石颗粒剂防治肾结石的作用机制。方法:采用乙二醇、氯化胺法致大鼠肾结石,同时每天1次ig给予溶石颗粒剂5.8,11.6,17.4 g.kg-1,实验全程21 d。每7 d作以下测定:尿标本以EDTA法测定钙浓度,比色法测定草酸浓度;肾组织HE染色,以免疫组化法检测大鼠肾骨桥蛋白的表达。结果:模型组大鼠肾OPN的表达明显增加,与溶剂对照组相比P<0.01,其中21 d模型组OPN的表达最高,OPN的表达为溶剂对照组的1.4倍(0.281 3/0.201 8);溶石颗粒剂各剂量组均能明显抑制大鼠肾结石模型OPN的表达(P<0.05),且呈现明显的量效关系;溶石颗粒剂各剂量组能减轻大鼠肾脏草酸钙结晶程度,显著降低大鼠尿钙和草酸浓度(P<0.01)。结论:溶石颗粒剂可以抑制大鼠肾结石模型中OPN的表达。

柳树叶提取物诱导肝癌细胞株hep-G2凋亡的实验研究

目的:研究柳树叶水提物抗肿瘤作用,为最终提取一种有效抗肿瘤药物及临床前实验提供依据。方法:柳树叶水提物制备药物血清作用于培养的肝癌细胞株hep-G2,检测其凋亡。采用端粒重复序列扩增(TRAP)法结合非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测端粒酶活性。结果:柳树叶水提物制备药物血清对靶细胞有明显的抑制生长现象。孵育一段时间后,能使肝癌细胞发生凋亡,并呈现对浓度的依懒性和伴随端粒酶活性下降。结论:柳树叶提取物能诱导肝癌细胞株hep-G2凋亡。

Morphogo骨髓细胞形态分析系统对正常、感染及多发性骨髓瘤骨髓涂片辅助诊断的效率评价

目的观察Morphogo骨髓细胞形态分析系统在正常、感染及多发性骨髓瘤骨髓涂片辅助诊断的效率。方法收集正常、感染和多发性骨髓瘤骨髓涂片各30例,采用人工显微镜检查和仪器预分类、人工复核的方式进行分析与诊断,通过比对人、机总耗时来评估仪器的辅助诊断效率。结果Morphogo对正常、感染和多发性骨髓瘤骨髓涂片有核细胞预分类的总准确度分别为85.7%、84.4%和63.0%。仪器组、人工显微镜检查组的诊断与临床诊断之间的符合率均为100%。正常组、感染组中,仪器辅助下的分片与诊断耗时较人工显微镜检查短(P<0.001)。而多发性骨髓瘤组中,耗时差异无统计学意义(P=0.098)。结论Morphogo能辅助提高正常和感染患者骨髓涂片的诊断效率。

尼克酰胺-N-甲基转移酶单克隆抗体的制备及鉴定

尼克酰胺N-甲基化酶（nicotinamide N—methytransferase，NNMT）是S-腺苷-L一蛋氨酸依赖的胞质酶。其主要的生物学作用是参与生物转化，催化一些吡啶衍生物，如吡啶、喹林、β-咔林等的甲基化。这种酶存在人体内多种组织中，其中在肝脏组织中表达量最大，而在其他组织，如。肾脏、肺、骨骼肌、心脏、脑组织仅有微量表达。

类风湿关节炎患者外周血淋巴细胞表面程序性凋亡分子-1的表达及意义

近年来，RA的研究备受关注。研究已证明，RA与机体免疫反应及免疫调节紊乱有关，RA的免疫学异常包括T淋巴细胞亚群失调和T淋巴细胞表面分子异常表达。PD-1／PD-L通路在免疫调节中起重要作用，PD-1为免疫抑制分子，属于Ⅰ型跨膜蛋白，表达在活化的T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞上，在维持淋巴细胞稳态方面起关键作用。

VCS技术在急性白血病及其亚型判断中的应用评价

目的 探讨LH750血细胞分析仪VCS技术在急性白血病及其亚型判断中的应用价值.方法 选取178例急性白血病患者,包括105例AGL、42例ALL、31例AMOL;同时选取151例非白血病对照者,包括粒系对照组86例、淋系对照组35例、单核系对照组30例.采用LH750血细胞分析仪的VCS技术对各组患者的外周血标本进行VCS参数检测.以显微镜镜检为标准,判断VCS技术检出幼稚细胞的能力;分析各组患者中性粒细胞各项VCS参数（MNV、MNV-SD、MNC、MNC-SD、MNS、MNS-SD）、淋巴细胞各项VCS参数（MLV、MLV-SD、MLC、MLC-SD、MLS、MLS-SD）、单核细胞各项VCS参数（MMV、MMV-SD、MMC、MMC-SD、MMS、MMS-SD）的差异和变化;并对AGL各亚型组间VCS参数的差异进行比较分析;通过观察白血病患者的VCS三维散点图,结合仪器阳性提示,判断VCS技术有效提示各系白血病的能力.结果 以显微镜镜检为标准,VCS技术识别幼稚细胞的敏感度为95.5%（170/178）,特异度为95.4%（144/151）.AGL组MNV、MNV-SD、MNC、MNC-SD值分别为224.40±23.37、37.40±12.31、145.80±7.93、24.79±5.18,均高于粒系对照组的169.96±11.50、29.21±5.27、133.30±5.50、10.62±4.09,差异有统计学意义（t值分别为16.832、5.148、5.735、19.953,P均＜0.01）,MNS值为122.90±6.35,低于粒系对照组的131.00±5.69,差异有统计学意义（t=-7.64,P＜0.01）;ALL组MLV、MLV-SD、MLC、MLS、MLS-SD值分别为97.60±13.40、22.35±7.94、110.00±4.60、77.60±19.00、20.61±3.30,高于淋系对照组的82.10±3.00、14.41±2.35、100.60±2.70、48.10±3.50、17.60±1.60,差异有统计学意义（t值分别为7.576、6.118、4.041、9.353、2.988,P均＜0.05）;AMOL组MMV、MMV-SD、MMC、MMC-SD、MMS值分别为197.30±20.50、30.47±6.58、123.20±10.10、6.57±1.57、98.00±5.60,高于单核系对照组的167.80±15.77、21.90±9.64、113.60±6.73、5.20±3.21、84.20±14.35,差异有统计学意义（t值分别为6.332、4.033、4.650、2.993、6.273,P均＜0.01）.AGL各亚型组之间,MNV、MNV-SD、MNC、MNC-SD、MNS-SD值差异有统计学意义（F值分别为21.2、169.5、13.6、3.6、98.6,P＜0.01）,而MNS值差异无统计学意义（F=2.1,P＞0.05）.AGL、ALL、AMOL各组散点图分布于相应幼稚细胞区域的比例分别为81%（85/105）、74%（31/42）、74%（23/31）.结论 VCS参数能较敏感地反映急性白血病外周血细胞的形态学变化,VCS技术对急性白血病的判断有预测作用.

类风湿关节炎患者Foxp3^＋CD4^＋CD25^＋T细胞的流式细胞术检测及意义

类风湿关节炎（RA）是一种自身免疫性疾病。CD4^＋CD25^＋调节性T细胞（Treg），是近几年来确定的一类T细胞亚群。在维持机体免疫自稳及调控免疫应答方面起重要作用。RA的免疫学异常包括T细胞亚群失调和T细胞的异常活化。Treg在维持自身免疫耐受及阻止自身免疫反应的发生中起重要作用。目前的研究已初步认为，Foxp3特异性表达在CD4^＋CD25^＋Treg上。我们采用流式细胞术检测CD4^＋CD25^＋Treg内的特异性标志Foxp3的表达，为进一步了解RA的发病机制及进行免疫治疗提供依据。