云南省猪戊型肝炎病毒全基因组扩增及进化分析

目的对猪戊型肝炎病毒全长基因组进行扩增,分析其进化关系,为HEV的感染性克隆研究奠定基础。方法利用巢式逆转录聚合酶链反应(RT-nPCR)和RACE技术对猪粪便中HEV样品进行全基因组扩增,利用DNAStar和MEGA4.0软件进行同源性比较和进化树分析。结果 RT-nPCR方法扩增出HEV的5段目的基因序列和RACE技术扩增出HEV的5′和3′端,序列比对结果正确,HEV全长扩增成功。同源性分析显示其与新疆株(GU119961)同源性较高(96.1%)。系统进化树显示该病毒属于基因4型h亚型猪HEV。结论 HEV全基因组序列扩增成功,为深入研究HEV奠定基础。

戊型肝炎病毒与ING5相互作用的研究

目的构建ING5基因真核表达载体和ING5荧光素酶载体,将pMIR-Report-ING5荧光素酶质粒与PUCHEV质粒共转染293T细胞后,验证HEV与ING5之间相互关系。方法通过提取293T细胞总RNA,RT-PCR法扩增ING5基因序列,并克隆到真核表达载体PGC3.1(+)上。利用脂质体转染法将PGC-ING5真核表达质粒转染HepG2细胞后,通过Western Blot法检测ING5表达情况;将pMIR-Report-ING5荧光素酶质粒和PUC-HEV质粒共转染293T细胞进一步探究ING5与HEV之间相互作用关系。结果经双酶切和测序鉴定真核表达质粒PGC-ING5构建成功,ING5基因在HepG2细胞中成功表达;将pMIR-Report-ING5荧光素酶质粒与PUC-HEV质粒共转染293T细胞后,发现HEV明显抑制239T细胞中pMIR-Report-ING5荧光素酶的活性。结论成功构建了PGC-ING5真核表达载体和pMIR-Report-ING5荧光素酶载体,并且证明HEV与ING5之间具有相互作用。

锌指抗病毒蛋白抑制HEV体内复制

目的探究锌指抗病毒蛋白(zinc finger antiviral protein,ZAP)对戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)体内复制的影响。方法通过构建ZAP真核表达载体,注射BALB/c小鼠后接种HEV,研究HEV体内复制情况。以18T-ZAP为模板,逆转录-聚合酶链式反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)扩增ZAP基因序列,并克隆至真核表达载体pcDNA3.1上。BALB/c小鼠尾静脉注射不同浓度pcDNA3.1-ZAP,随后接种HEV。实时荧光定量PCR(Quantitative Real-Time PCR,RT-qPCR)和免疫组化检测ZAP对HEV复制的影响。结果经双酶切和测序鉴定真核表达质粒pcDNA3.1-ZAP构建成功;将注射ZAP的小鼠接种HEV,发现HEV复制被显著抑制。结论本研究表明ZAP能抑制HEV体内复制,为HEV的防治提供基础。

携带EGFP基因的戊型肝炎病毒重组质粒的构建及其感染性的验证

为了构建携带增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因的戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)重组质粒,转染人肺癌细胞A549细胞验证其感染性,PCR法分两段扩增HEV全基因组序列和EGFP基因序列,将EGFP报告基因插入到HEV ORF2基因下游,并克隆到体外转录表达载体pGEM-7Zf(+)上。然后利用脂质体转染法将重组质粒转入A549细胞,24h后在荧光显微镜下观察EGFP的表达;转染72h后,利用免疫荧光法检测HEV ORF2蛋白的表达。转染7d后将发生病变的A549细胞收集作为接种物,接种A549细胞验证携带EGFP的HEV-EGFP重组病毒的感染性。结果显示经酶切和测序鉴定携带EGFP的HEV重组表达质粒pGEM-HEV-EGFP构建成功;EGFP基因与HEV在A549细胞中可融合表达;携带EGFP的HEV重组表达质粒转染A549细胞7d后出现病变,并且连续传代3代仍具有感染性。本研究成功构建了携带EGFP的HEV全基因组重组质粒pGEM-HEV-EGFP,并成功感染A549细胞,为进一步研究HEV的复制机制及致病机理奠定基础。

戊型肝炎病毒感染孕妇的致病机制研究

戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)是引起急性肝炎的主要原因之一。戊型肝炎通常是一种自限型疾病,但对孕妇和胎儿存在十分严重的危害,妊娠晚期孕妇感染HEV后死亡率高达25%,并极易造成胎儿早产、流产或死胎。目前HEV感染导致孕妇较高死亡率的原因还不清楚,本文将对HEV感染孕妇的流行病学及可能的致病机制作一综述。

戊型肝炎病毒感染性克隆的构建及应用进展

感染性克隆技术是在分子病毒学研究领域兴起一门新型技术,即在病毒的遗传物质水平研究其复制机制和致病机理,并拯救病毒。构建戊型肝炎病毒（hepatitis E virus, HEV）感染性克隆是对 HEV 实施反向遗传操作技术的前提和基础,文章综述了 HEV 感染性克隆的构建策略、方法及应用。

信号调节蛋白-α基因真核表达质粒的构建及其在A549细胞中的表达

目的构建信号调节蛋白-α(signal regulatory protein-α,SIRP-α)基因真核表达质粒,并于A549细胞中进行表达。方法提取Hep G2细胞总RNA,RT-PCR扩增SIRP-α基因片段,克隆至真核表达载体pc DNA3.1(+)-EGFP中,构建真核表达质粒pc DNA3.1(+)-SIRP-α/EGFP。将重组表达质粒转染A549细胞,转染24 h后,荧光显微镜下观察转染情况;转染48 h后,RT-PCR检测SIRP-α基因的转录水平;转染72 h后,Western blot法检测SIRP-α蛋白的表达。结果经双酶切和测序鉴定真核表达质粒pc DNA3.1(+)-SIRP-α/EGFP构建正确;转染pc DNA3.1(+)-SIRP-α/EGFP的A549细胞于荧光显微镜下可见绿色荧光;RT-PCR检测结果可见243 bp目的条带,Western blot检测显示SIRP-α存在。结论成功构建了真核表达质粒pc DNA3.1(+)-SIRP-α/EGFP,并于A549细胞中有效表达,为进一步研究SIRP-α与肺癌的相关性奠定了基础。

戊型肝炎病毒感染HepG2细胞蛋白质组学研究

比较人肝癌细胞系HepG2细胞感染和未感染HEV后细胞内蛋白质表达谱的变化，为初步探索HEV在宿主细胞内感染机制及致病机理奠定基础。方法RT．nPCR和免疫荧光确认HEV感染HepG2细胞后．利用同位素标记相对和绝对定量（isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation，iTRAQ）技术比较HEV感染组与未感染组HepG2细胞蛋白质表达差异。结果HEV感染导致328种蛋白发生变化，与未感染组相比，262种蛋白表达上调，66种蛋白表达下调。结论HEV感染HepG2细胞导致大量蛋白差异表达．功能预测表明这些蛋白涉及到宿主的物质代谢、细胞信号转导、免疫蛋白、细胞骨架成分等方面，为今后研究HEV感染机制和致病机理奠定基础。

细丝蛋白A shRNA慢病毒载体的构建及其干扰效率的检测

目的构建细丝蛋白A(filamin A,FLNa)shRNA慢病毒载体,并检测其在肝癌细胞Hep G2和Huh7中的干扰效率。方法通过合成干扰基因片段,插入至shRNA慢病毒载体GV298中,构建FLNa shRNA慢病毒载体shRNAFilamin1和shRNA-Filamin2,转染Hep G2和Huh7细胞,荧光显微镜下观察红色荧光表达,Western blot法检测Filamin A干扰效率。结果构建的FLNa shRNA慢病毒载体经测序证明构建正确;转染24 h后,Hep G2和Huh7细胞可见红色荧光;转染48 h后,shRNA-Filamin1和shRNA-Filamin2的干扰效率在Hep G2细胞中分别约为45.4%和63.7%,在Huh7细胞中分别约为76.5%和78.3%。结论成功构建FLNa shRNA慢病毒载体,在Hep G2和Huh7细胞中干扰效率较高;可与多种病毒的受体蛋白相互作用,从而参与病毒的复制周期,为今后病毒复制及其致病机理的研究提供了新的思路。

锌指抗病毒蛋白ZAP对病毒的作用

锌指抗病毒蛋白（zinc finger antiviral protein，ZAP）是一种具有抗病毒活性的宿主细胞限制因子．ZAP能通过介导病毒mRNA的降解以及抑制翻译，从而抑制病毒的复制。ZAP能够抑制鼠白血病病毒、人类免疫缺陷病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、辛德比斯病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒的复制。本文主要就ZAP的抗病毒作用作一综述。

戊型肝炎病毒感染调控TLR3信号通路的研究

戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)是导致急性戊肝的主要原因.通过建立基因IV型HEV感染A549细胞模型,研究病毒感染后TLR3信号通路相关因子表达的变化.病毒感染A549细胞后通过实时荧光定量PCR检测IFN-β的mRNA表达量,Western blot分析磷酸化IRF3(pIRF3)和IKKε蛋白表达水平的变化.结果表明:HEV感染A549细胞后细胞内IFN-β的相对表达水平显著下降,TLR3信号通路介导的pIRF3及IKKε蛋白在病毒感染后表达量显著下降.基因Ⅳ型HEV能够抑制TLR3信号通路介导的IRF3的磷酸化及IKKε蛋白的表达,从而抑制了IFN-β的表达,为进一步研究HEV复制机制和致病机理奠定基础.