基于体温扩增的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病变种3种可视化快速检测方法的建立

为实现食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病变种(Burkholderia gladioli pv. cocovenenans)的快速检测,基于体温扩增技术——酶促重组等温扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA),并根据唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病变种bonM基因序列设计和筛选了ERA检测引物和探针,分别建立ERA显色法、荧光法、试纸条法3种可视化快速检测方法,并评估其特异性和灵敏度,以及在市售样品检测适用性和准确性。结果显示,建立的方法对3株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病型菌株均有扩增,其他常见的食源性致病菌以及其他唐菖蒲伯克霍尔德氏菌均无扩增,说明检测方法的特异性良好。3种方法的检出限均为10^(-2)ng/μL,灵敏度较好。采用建立的3种可视化快速检测方法对15份市售样品进行检测,检出阳性2份,检出率为13.3%。该结果与国标方法的检测结果一致,说明方法具有较好的适用性和准确性。本研究建立的基于体温扩增技术的显色法、荧光法和试纸条法具有较高的特异性及灵敏度,37℃体温扩增15 min左右即可获取检测结果,且裸眼可视,可为食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病变种的现场可视化快速筛查提供新型简便的策略。

食源性甲型肝炎病毒快速检测技术研究进展

病毒在食源性疾病的爆发中起着至关重要的作用,其中,甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)感染后能够致人衰弱,并引发急性肝衰竭。由于其传染迅速,影响范围广,HAV污染已经给消费者带来了严重的健康风险,且在全球范围内造成了大规模的食源性疫情和经济损失。因此,早期快速准确的检测HAV对于食品安全和疫情暴发的溯源至关重要,以便及时确定并召回受污染的食品,防止感染的进一步发生。传统的HAV检测方法由于检出率不高以及病毒在细胞内的培养周期长等问题,往往耗时费力,无法快速有效地对其进行检测。本文对目前报道较多的HAV快速检测技术进行了阐述和梳理,对各项技术的检出限、检测时间以及优缺点进行了比较,并对HAV快速检测技术研究进行了展望,为后续HAV的快速检测研究提供依据,也有助于进一步探讨与开发HAV快速检测的新技术,以有效防止HAV的传播与危害。

沙门氏菌ERA可视化快速检测方法的建立

为实现食品中沙门氏菌的快速检测,选用文献报道的沙门氏菌RPA引物和探针,建立酶促等温扩增(ERA)荧光法和显色法两种沙门氏菌可视化快速检测方法,并分析两种方法的特异性、灵敏度、检出限等指标。同时,为满足实验室外现场检测环境的要求,分别采用自热包和热帖作为现场DNA提取和ERA反应的热源,建立不依赖实验室设备的方法。优化后两种ERA方法检测时间分别为11 min和4 min,灵敏度均可达10^(-2) ng/μL,人工污染样品增菌培养4 h后检出限为1 CFU/mL。本研究创新性地将沙门氏菌RPA引物探针应用到ERA检测体系,建立了荧光法和显色法两种可视化快速检测方法,并集成现场DNA提取和ERA反应检测套组,提高了扩增效率,摆脱了对传统实验室设备的依赖,对于推进食源性致病菌现场可视化快速检测具有重要意义。

麦卢卡蜂蜜植物源性成分鉴别方法的建立

建立植物源性检测方法鉴别麦卢卡蜂蜜真伪。比较不同方法对麦卢卡蜂蜜花粉沉淀的DNA提取效果,建立麦卢卡蜂蜜上清液DNA提取方法,以及麦卢卡蜂蜜中植物内参照、麦卢卡、卡奴卡3种物种源性成分检测的实时聚合酶链式反应方法。通过对方法的特异性、灵敏度、检出限的分析,以及与新西兰初级产业部(Ministry for PrimaryIndustries,MPI)方法的比较,证实了本研究建立方法的可行性、准确性与等效性。本研究不仅建立了一种可以替代MPI麦卢卡蜂蜜DNA检测的方法,避免对其产品的依赖性,还弥补了MPI仅对麦卢卡蜂蜜花粉沉淀进行鉴别的不足,这对麦卢卡蜂蜜的真伪鉴别具有重要的应用价值和科学意义。

GI和GII诺如病毒ERA的可视化快速检测

诺如病毒(NoV)是常见的食源性病毒之一,只要极少数量的NoV就可以导致机体感染发病,但目前还没有特效的治疗药物和疫苗,因此建立快速检测方法对食品中的NoV进行早期筛查至关重要。本研究首先通过装甲RNA技术将GB 4789.42规定的GI和GII NoV的靶标基因包裹到MS2噬菌体的衣壳蛋白中,制成内含GI和GII NoV两联检测靶标的重组质粒参考样品,其次基于酶促等温扩增(ERA)技术,分别设计了GI和GII NoV基础型ERA和荧光型ERA检测的引物和探针,并通过试验筛选确定了最佳的引物探针组合。从而建立了GI和GII NoV检测ERA显色法和荧光法两种可视化方法,通过肉眼可直接观测结果。进一步对反应程序进行了优化,将ERA显色法和荧光法的扩增时间分别缩短至5min和8min。并通过对反应体系的优化,将体系减半,从而降低了检测成本。在此情况下,对核酸参考样品检测的最低灵敏度分别可达10^(-2)、10^(-3)ng/μL。最后将本研究建立的可视化快速检测方法应用于真实的GI和GIINoV粪便样本检测,并对方法的性能参数进行分析,结果显示:建立的GI和GII NoV ERA可视化快速检测方法特异性良好,对其他食源性病毒无交叉扩增,最低可检出10拷贝/μL的NoV,可以满足GI和GII NoV可视化快速筛查的需求。本研究方法的建立为NoV的快速筛查和风险监测提供了良好的技术支撑,对于控制NoV爆发、保障人民健康具有重要意义。

婴儿配方乳粉中食源性致病菌双重ERA快速检测方法的建立

为快速多重筛查婴儿配方乳粉中食源性致病菌的污染情况,建立克罗诺杆菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌及金黄色葡萄球菌双重酶促重组等温扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA)快速检测方法。首先,通过筛选确定对4种食源性致病菌特异性好、扩增效率高的引物探针。经过优化建立两组双重ERA检测体系可快速筛查4种食源性致病菌。该方法对沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌及金黄色葡萄球菌的检出限均为10^(-2) ng/μL;对克罗诺杆菌的检出限为1 ng/μL。模拟污染实验显示,污染量为1 CFU/mL的样品增菌培养6 h后,可检出4种致病菌。应用该方法对市售婴儿配方乳粉样品进行检测,检测结果与行业标准规定的实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)法一致,证实了本研究建立的双重ERA检测方法的准确性和可靠性。采用本方法仅需20 min左右即可一次性检出4种致病菌,相较于传统的“金标准”方法以及实时荧光PCR法显著提高了检测效率,对于推进食源性致病菌的快速筛查具有重要意义。

GⅠ和GⅡ诺如病毒RAA可视化快速检测方法的建立

诺如病毒(NoV)是引起全球急性肠胃炎疾病的主要病原体之一,极易爆发传播,增加医疗与经济负担。目的:通过重组酶介导等温扩增技术(RAA)开发一种新型的NoV检测方法。方法:根据ISO TS 15216-2-2013、GB 4789.42规定的GⅠ和GⅡ NoV检测靶标所对应的cDNA序列,设计并筛选最佳RAA引物及探针,确定其对其它常见食源性腹泻病毒的特异性。通过优化确定最短检测时间、反应程序以及反应体系,分析该检测体系下对NoV参考质粒和真实样本检测的灵敏度,从而建立GⅠ和GⅡ NoV RAA可视化快速检测方法。结果:所建立的RAA检测方法特异性好,与其它食源性病毒无交叉反应。在保证扩增效率的前提下,优化后的反应程序可将检测时间缩短为10 min左右,反应成本可减少三分之二。对参考质粒和真实样本检测的灵敏度分别达10^(-2)ng/μL和1 ng/μL。结论:本试验建立的两种NoV检测方法特异性强、灵敏度高,且简单、快速、可视,为今后NoV快速检测奠定良好的基础。

重组酶聚合酶扩增、重组酶介导等温扩增及酶促重组等温扩增技术在食源性致病菌快速检测中的研究进展

随着人民生活水平的提高,食品安全问题也越来越受到社会关注,其中生物(微生物)因子是影响食品安全的最主要因素。食品安全研究领域针对生物(微生物)因子的检测技术众多,其中等温扩增技术因不需依赖复杂的仪器设备,能够快速、准确地进行生物成分检测而被广泛应用,尤其是新发展起来的重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)、重组酶介导等温扩增(recombinase-aided amplification,RAA)和酶促重组等温扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA)技术。这3种等温扩增技术相对于其他等温扩增技术具有反应条件更温和、引物设计更简单等优点,且检测原理相似,本文对这3种技术进行对比研究,从原理、概念以及近年来在食源性致病菌快速检测方面的研究应用情况进行综述,概括其在食品检测中的优势和面临的实际问题,并对未来的发展前景进行展望。

甘草提取物的生物功能评价及相关质量标志物预测

为研究不同品种甘草提取物的护肤相关生物功能差异及其影响因素,筛选出可用于表征甘草提取物护肤活性优劣的质量标志物(Q-Markers),测定甘草提取物中总黄酮、总皂苷和总多糖,以及甘草酸、甘草苷、光甘草定、异甘草苷、甘草素、甘草次酸和异甘草素7种主要活性单体的含量,并在细胞水平对商品乌拉尔甘草、胀果甘草和光果甘草提取物的保湿及美白功效进行比较研究,进而对甘草提取物的主要活性成分含量及护肤相关生物功能进行了相关性分析。比较研究结果显示,保湿活性方面,乌拉尔甘草和胀果甘草具有显著优势,而美白活性方面,光果甘草具有显著优势。相关性分析结果显示,总多糖、甘草素和甘草次酸含量与保湿活性具有较强正相关性,光甘草定、总黄酮和异甘草苷含量与美白活性具有较强正相关性。综上所述,不同品种甘草提取物的护肤功效不尽相同,需针对不同功效需求进行区分使用。另外,筛选出总多糖、甘草素和甘草次酸可作为甘草保湿活性的潜在质量标志物,筛选出光甘草定、总黄酮和异甘草苷可作为甘草美白活性的潜在质量标志物。

双重荧光RT-ERA技术快速检测贝类食品中诺如病毒

目的:基于逆转录-酶促重组等温扩增(reverse transcription-enzymatic recombinase amplification,RTERA)技术,以MS2作为模式过程控制病毒,建立一种贝类食品中GI与GII型诺如病毒(norovirus,NoV)双重荧光RT-ERA快速检测方法。方法:分别将GI、GII NoV参考靶序列克隆到带有T7启动子的载体中,通过体外转录的方式获得高纯度NoV RNA参考样品。以设计的MS2噬菌体引物探针,与实验室前期筛选的GI、GII NoV引物探针进行双重荧光RT-ERA实验,并对反应体系和反应程序进行优化,分析方法的灵敏度。最后,采用建立的方法开展真实样本检测,以GB 4789.42-2016《食品微生物学检验诺如病毒检验》为参比方法进行检测结果对比,确定方法的准确性和可行性。结果:建立MS2与GI、MS2与GII两组双重荧光RT-ERA检测方法,最佳引物及探针体积分别为4.1μL与1.8μL,检测时间可缩短至10 min左右,且最低可检出102拷贝/μL的NoV核酸样品。应用所建立的方法对29份真实样品进行检测,检测结果与GB 4789.42-2016一致。结论:本研究建立的双重荧光RT-ERA检测方法可实现对MS2、GI和GII NoV的同时检测,且灵敏度高、准确性强,为今后NoV现场快速检测提供一定基础。

多重real-time PCR技术快速鉴别特种乳中的乳源动物成分

建立一种特种乳中乳源动物成分快速鉴别多重实时聚合酶链式反应技术。通过筛选建立8种不同乳源物种检测的多重实时聚合酶链式反应方法,在一个反应体系里可同时检测4种乳源的特异性靶基因,绝对灵敏度达0.1~5 pg/μL,检出限可达0.1%。同时,建立了高效的DNA提取方法,样品裂解后可在12 min左右完成96个样品的DNA提取,大大缩短了样品前处理时间。采用该方法对市售特色乳产品进行调查,结果显示标识不准确的产品比例达36.36%。

玉米D亚族bZIP转录因子基因的数据库挖掘、分析、克隆与表达

碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper,bZIP)是真核生物特有的转录因子家族,在高等植物基因表达与调控中起重要作用。本文通过对玉米基因组数据库中收录的全长cDNA序列全基因组范围的bZIP分析,发现其中25个序列编码D亚族bZIP转录因子。针对这些序列进行生物信息学分析、染色体分布和直系同源组的分类分析,发现部分序列可能是由同一基因座编码,但不同方式剪切形成的。对部分基因克隆和测序发现了更多的剪切形式。定量检测其中3个基因在ABA和干旱胁迫条件下的表达发现,其中1个受ABA诱导,2个受ABA抑制,但均不受干旱胁迫影响。表明玉米中D亚族基因可能参与ABA响应。

毛细管电泳技术检测羊乳婴幼儿配方粉中的牛乳成分

婴幼儿配方乳粉的乳源鉴别对于保障产品安全和真实性至关重要。采用毛细管电泳技术对羊乳来源的婴幼儿配方粉中的牛乳成分进行检测。通过比较不同乳源产品中主要蛋白质组分的电泳图谱,筛选出牛乳表征蛋白峰。通过方法验证以及检测市售样品,证实毛细管凝胶电泳在准确度、精密度及重复性方面表现良好,筛选的表征蛋白峰峰面积与羊乳中牛乳含量呈现良好线性相关性(R^2>0.99),检测灵敏度0.5%,表明该方法可用于羊乳来源婴幼儿配方粉中牛乳成分的定性和定量检测。

玉米A亚族bZIP转录因子基因ZmbZIP81的克隆、表达与功能分析

碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper,bZIP)蛋白是真核生物所特有的一类转录因子,对于植物在逆境下的基因表达调控具有重要作用。为丰富对玉米bZIP转录因子功能的认识,本研究以从玉米中克隆到的一个A亚族bZIP转录因子编码基因ZmbZIP81为对象展开。ZmbZIP81基因位于玉米第6染色体,编码区全长2492 bp,由4个外显子和3个内含子组成,编码蛋白含254个氨基酸。研究表明ZmbZIP81基因表达受外源ABA、NaCl和干旱胁迫诱导。过表达该基因的拟南芥植物表现出ABA不敏感和NaCl胁迫抗性增强的表型,推测ZmbZIP81可能作为ABA信号途径的负调控因子参与植物抗逆基因表达调控网络。

双向电泳技术鉴别牛羊乳品真实性

采用双向电泳技术对牛羊乳品的蛋白质指纹进行分析。首先通过全乳图谱分析牛羊乳的差异蛋白,然后针对婴幼儿配方粉、乳清粉等开展方法特异性研究,通过婴幼儿配方粉添加实验开展方法灵敏度研究,最后对市售配方粉、液态乳、酸乳等进行检测。总体上,双向电泳技术信息丰度高,信息直观,重复性良好,能准确分辨牛羊乳及乳清,灵敏度达到5%。通过检测,8份市售样品中有1份酸羊乳实际为牛乳,图谱蛋白指纹信息清晰,直观反映产品真实性。

快速蒸发电离质谱技术(REIMS)鉴别肉品

随着食品工业发展及人民生活水平的提高,人们对于高品质、高营养食品的需求量越来越大,在经济利益驱动下,肉品掺假现象日益严重。肉品真实性检测技术是食品科学领域的研究热点,其中快检技术对于开展食品供应链追溯和实时检测具有重要意义。本工作采用快速蒸发电离质谱技术(REIMS)研究其在肉品及水产类食品的物种快速鉴定中的关键性能指标。结果表明,通过对12种畜类、6种禽类和13种水产类样品的参数优化、数据采集和模型建立,确定该方法对动物种属的分辨率、判别率和稳定性指标,其识别准确率分别为96.56%、99.71%和96.33%。通过差异因子分析,鉴定出14种畜类和12种禽类特征物质。差异因子的分析可为未来方法的验证、标准化和量化研究提供依据。

采用双向电泳技术研究牛乳热加工后蛋白质组变化

采用双向电泳技术建立牛乳蛋白质组检测方法,研究不同热加工条件对牛乳主蛋白成分含量的影响,从而对不同热处理牛乳,包括鲜乳,巴氏乳,复原乳等进行鉴别。

高通量二代测序基因条码技术在油料作物种类鉴别中的应用

对高通量二代测序基因条码技术在油料作物种类鉴别中的应用进行探索。采用Ion Torrent PGMTM测序技术,分别对橄榄、花生、大豆、油葵、玉米等14种油料作物和小麦、大米的叶绿体核酮糖二磷酸羧化酶/氧化酶大亚基(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit,rbc L)基因246 bp聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)产物混合物,及上述作物DNA混合液扩增得到的rbc L基因片段进行测序。结果表明,除小麦外,所有其他作物成分均获得了鉴定。其中,PCR产物混合物中每种作物成分的测序读数数量比例和该成分PCR产物在总产物中的比例接近,说明该技术可以用于定量分析。实验结果初步证实了该技术对混合样品中各作物种类鉴别的准确性,并具有检测效率、流程简便的特点,有望在未来成为食用油标识符合性查验的有力工具。

采用毛细管凝胶电泳技术检测常见乳源成分

常见乳源真伪检测方法的开发对于特色乳品产业开发以及保障消费者安全与权益都有着重要的作用。本研究采用毛细管凝胶电泳技术,对牛乳及水牛乳、牦牛乳、驴乳、马乳、羊乳、骆驼乳等特色乳品进行测试。通过计算各乳品蛋白峰与内标蛋白相对迁移时间,以及差异蛋白峰面积比值,构建聚类分析模型,筛选不同乳品靶标蛋白峰以及判定标准。通过对方法稳定性、重复性、检出限等参数的研究,构建常见乳源成分评价体系。此外,对市售样品进行检测,证明本方法可以实现对靶标乳源蛋白的快速筛查。

适用于极区环境的直升机研制关键技术与未来发展

极区具有重大的经济和科技价值,直升机在我国历次南北极科考活动中发挥了重要作用。为牵引适用于极区环境的直升机技术发展,该文通过分析极区地理气象环境、我国直升机在极区的任务剖面,构设了直升机使用场景和关键技术需求,并研究分析了各项关键技术的技术内涵和未来发展方向。通过重点发展冰雪地起降、复杂环境飞行、防冰防雨、低温使用、舱内加温保温等关键技术,使直升机能适应极区复杂地理气象环境、极端低温环境,并能在极地无人区进行自主保障,是未来发展的方向。