体外抑制肿瘤JAK/STAT通路探讨STAT4对肿瘤免疫的影响

利用小 RNA 技术对肿瘤细胞系 Mosec 中 STAT4蛋白的表达进行干预,结合用干预后的肿瘤细胞培养上清液与脾细胞共培养后流式细胞分析的方法,检测 CD4+CD25+Treg 细胞被引导情况.得到了抑制肿瘤细胞 STAT4后,引导出增高比例的 CD4+CD25+Treg 细胞的结果.进一步检测培养上清液中细胞因子TGF-β2和 IL-10 mRNA 的表达,发现肿瘤细胞 STAT4蛋白表达被抑制后,IL-10分泌明显增加,而 TGF-β2没有明显改变.这一结果暗示着肿瘤细胞是通过 STAT4的激活来下调 IL-10的表达和 CD4+CD25+Treg 细胞比例,来削弱对 T 细胞增殖的抑制效应,进而增强机体对肿瘤免疫的可能性.

不同Toll样受体介导的树突状细胞因子表达

目的研究树突状细胞在不同Toll样受体(TLR)配体刺激下的早期反应。方法将鼠骨髓细胞诱导分化得到DC,利用TLR配体刺激,采用芯片分析方法研究其免疫相关基因在9h的表达;采用细胞因子分析系统,检测了12、48h细胞培养上清中细胞因子、趋化因子的产生。结果在给予LPS、PolyI:C、R848、CpG和anti-CD40刺激9h后,IL-1、IL-2rg、IL-13、CCL2、CCL4和CCL7的基因表达明显升高,CCL3、CCL5和CXCL9、CXCL10、CXCL11的表达增加最为显著(P<0.01);而IL-10(PolyI:C除外),CCL-6的表达降低(P<0.05)。培养12h后,IL-1、IL-6、IL-10、IL-12(p40)、IL-12(p70)、TNFa、G-CSF、GM-CSF、KC和MIP-1a(CCL3)产生在5种TLR配体刺激下均显著增加(P<0.01);培养48h后,IL-1、IL-10、IL-12(p40)、IL-12(p70)、TNFa、IFN-γ、G-CSF和MIP-1a(CCL3)产生也同样显著增加(P<0.01)。相对于其它TLR配体,CpG刺激时MIP-1a(CCL3)的产生增加更明显,与基因芯片结果相似。结论本研究揭示了不同TLR配体刺激对DC细胞因子和趋化因子表达量的调节,为TLR配体对DC分化和功能的作用机理提供了更多证据。

APOE对鼠RAW264.7细胞系内TLR信号通路的调节

目的分析载脂蛋白E基因(APOE)对RAW264.7细胞内的TLR信号通路的调节作用。方法克隆鼠APOE基因并建立表达APOE的RAW264.7稳定细胞系,使用各种Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)配体进行刺激,用报告基因化学发光检测转录因子活性,流式细胞仪检测细胞表面免疫分子。结果在LPS刺激下,APOE基因抑制NF-κB的活性(P<0.05),但对AP-1活性有促进作用(P<0.05);在PolyI:C刺激下,APOE促进NF-κB和AP-1两者的活性(P<0.05)。在PGN刺激时,APOE明显上调B7-H1的表达,但对CD86、PD-1、CD11c及Gr-1的表达有抑制作用。结论APOE基因可以调节TLR信号通路中NF-κB的活性,也可调节多个具有免疫调节功能的表面分子的表达,这样APOE可能具有免疫调节功能。

LRRC19识别肿瘤坏死因子α等炎症因子参与肾脏的免疫应答

研究一个已鉴定的富亮氨酸重复结构(LRR)蛋白家族成员LRRC19,确定其组织分布及在肾组织中的表达和定位,并对其功能进行初步研究.通过RT-PCR技术检测LRRC19 mRNA在小鼠各组织中的分布;利用特异性探针mRNA杂交技术对该基因在肾组织中的表达进行精确定位;免疫荧光实验分析该蛋白的亚细胞定位;通过分泌型碱性磷酸酶(Secreted Alkaline Phosphatase SEAP)检测技术,观察转染LRRC19后细胞中转录因子核因子(NuclearFactor NF)-κB和激活蛋白(Activator Protein AP)-1的活性改变,并探讨肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor TNF)α识别LRRC19对NF-κB信号通路的影响.RT-PCR和mRNA原位杂交实验结果显示,LRRC19 mRNA主要在肾组织中表达,并集中于肾小管上皮细胞,在脾和小肠组织中亦有表达;免疫荧光结果显示,FITC标记的LRRC19-V5融合蛋白位于细胞膜上,确定其为跨膜蛋白;LRRC19在细胞内异位表达可以不同程度的增强NF-κB和AP-1的活性,TNFα和IL-1β刺激后,NF-κB活性明显升高,TNFa刺激后表现尤为显著.作为存在于肾小管上皮细胞中的跨膜受体LRRC19,可通过识别病原体分子和致炎细胞因子,介导信号传导,启动相关细胞因子转录,调节肾组织的免疫防御作用.

MyD88aa155-171功能区缺失对免疫相关细胞共刺激分子和细胞因子表达的影响

利用重组PCR的方法,克隆并构建MyD88和MyD88aa155-171功能区缺失(MyD88Δ155-171)载体,转染免疫相关细胞并筛选获得稳定细胞系。报告基因实验结果显示MyD88MyD88Δ155-171功能区缺失能够抑制转录因子NF-κB和AP-1的活性,在不同Toll样受体(TLR)配体刺激后,转染MyD88Δ155-171的细胞表面分子的表达低于MyD88正常表达的细胞,并且抑制表面分子CD86和B7H1在TLR配体刺激后的上调。同时,多细胞因子分析系统的检测结果表明,给予TLR配体刺激之后,MyD88-/-树突细胞表达低水平的细胞因子,转染MyD88可以使细胞因子表达明显增加,而仅表达MyD88Δ155-171可以明显影响IL-12,IFN-γ的表达。以上结果表明MyD88功能区缺失影响免疫相关细胞表面分子和细胞因子的表达及Toll样受体信号的传递,其在细胞内信号系统的具体作用机制还需进一步证实。

肿瘤相关免疫抑制细胞与免疫逃逸机制研究进展

肿瘤相关树突细胞,髓系来源抑制细胞和肿瘤相关巨噬细胞等在肿瘤免疫逃逸过程中能够诱导免疫抑制反应。肿瘤源性因子可以影响其分化、功能和迁移。细胞内信号转导途径的激活可以调节细胞内代谢、细胞因子的产生和共刺激及共抑制分子的表达,由此产生免疫抑制作用。这些方面的研究将会为抗肿瘤免疫治疗提供新的策略。

SerpinH1对小鼠肿瘤细胞增殖的影响

目的研究SerpinH1基因对肿瘤细胞增殖的影响。方法克隆SerpinH1基因,建立相关稳定转染细胞系,分为5组,分别为空白对照组,pcDNA3.1/V5-SerpinH1实验组,pcDNA3.1/V5对照组,pNKRY-SerpinH1-siRNA实验组,pNKRY-GFP对照组。应用BrdU渗入法,流式细胞术检测,WST-1方法分别测定细胞增殖情况,并建立肿瘤细胞模型,用体内试验验证SerpinH1对肿瘤细胞生长情况的影响。结果过表达基因的pcDNA3.1/V5-SerpinH1组肿瘤生长有抑制作用,而用siRNA干扰技术沉默基因表达的pNKRY-SerpinH1-siRNA组肿瘤生长有促进作用。结论SerpinH1基因能够抑制肿瘤细胞生长,提示SerpinH1具有抑制肿瘤的功能。

一种新的磷酸伯氨喹脂质体的合成方法

脂质体作为一种药物载体,具有靶向性,降毒性,缓释性等许多优点。磷酸伯氨喹脂质体可显著降低磷酸伯氨喹的毒性。磷酸伯氨喹脂质体的制备主要有薄膜法和逆相蒸发法两种方法。这两种方法都有不足之处,薄膜法包封率低,逆相蒸发法对待包物质影响大。我们根据逆相蒸发法的原理,首次用二次乳化法制备伯氨喹脂质体。

多层次Fuzzy综合评判在肿瘤疫苗免疫生物治疗评价中的应用

应用多层次 Fuzzy综合评判方法评判肿瘤疫苗在抗肿瘤免疫生物治疗中的效果 ,此法客观、可靠 ,为医务人员综合评估肿瘤疫苗提供了一个良好的数学模型 .

限制性siRNA干涉文库的构建以及影响HeLa细胞增殖新功能基因的扫描

利用RNA干涉文库进行大规模高通量的功能基因扫描,已成为发现新功能基因的重要方式和手段.为了寻找在细胞增殖和分化过程中的新功能基因,根据斯坦福大学公布的与人类胚胎干细胞和造血干细胞增殖和分化过程中有关基因的基因芯片的分析结果,组建了与细胞增殖和分化有关的RNA限制性干涉文库.该文库包括靶向各类基因的载体,如包括转录因子、各类蛋白激酶、细胞周期调控蛋白以及一些未知功能基因在内的225个基因.利用这个限制性RNA干涉文库对控制HeLa细胞增殖的基因进行筛选.并通过WST-1高通量检测,发现了2个同HeLa细胞增殖相关的基因:CNKSR3(Homo sapiens CNKSR family member 3)和Fosl2(Homo sapiens FOS-like antigen 2),并初步证实:沉默CNKSR3会促进HeLa细胞的增殖,而沉默Fosl2则抑制HeLa细胞的增殖功能.

Prosaposin基因对TLR3信号途径的调节

目的研究prosaposin基因对转录活性因子和免疫细胞表面分子表达的影响,分析该基因在各种Toll-like re-ceptor不同途径中的作用,初步探讨prosaposin基因在免疫系统中的功能。方法克隆prosaposin基因并建立prosaposin基因稳定转染的细胞系,通过检测报告基因化学发光和用不同Toll-like receptor配体刺激后比较细胞表面分子的表达水平的方法来探讨不同途径中该基因发挥的作用。结果在TLR3配体PolyI:C刺激条件下,prosaposin基因能够明显促进对NF-κB以及AP-1的活性,而且明显抑制细胞表面分子B7H1和PD1的表达。结论prosaposin基因能够影响TLR3信号途径作用于免疫细胞,调节免疫相关细胞分子,可能在免疫系统方面起作用。

跨膜蛋白受体在LRRC19调节机体先天免疫应答反应中的作用

目的确定已初步鉴定的富亮氨酸重复结构(LRR)蛋白家族成员LRRC19在脾细胞中的表达及定位,并对其功能进行初步研究。方法通过生物信息学技术预测LRRC19蛋白结构;mRNA原位杂交和RT-PCR检测LRRC19mRNA在小鼠脾组织以及不同脾细胞中的表达;以不同细菌刺激LRRC19转染的293T细胞,通过分泌性碱性磷酸酶(SEAP)检测技术观察细胞分泌的NF-κB活性的改变。结果LRRC19是一种跨膜蛋白,属于LRR蛋白家族成员,胞外区存在串联排列的4个LRR基序,有单一的跨膜结构域,胞内区有2个酪蛋白激酶2(CK2)磷酸化位点;mRNA原位杂交和RT-PCR结果显示,LRRC19mRNA在脾脏主要表达于B1淋巴细胞;体外实验证实,多种细菌均可使转染LRRC19的细胞NF-κB活性增强。结论LRRC19可能是一种跨膜受体,可识别不同的病原体保守分子,可能参与介导细胞信号转导,激活NF-κB信号途径,启动靶基因转录,调节先天免疫应答过程。

巨噬细胞活性对伯喹脂质体抗疟效果的影响

用环磷酰胺、植物血凝素调节巨噬细胞的活性,观察了伯喹脂质体的抗疟效果。经注射环磷酰胺(200mg/kg)的伯喹脂质体组,小鼠肝组织单位面积(cm^2)疟原虫红外期数为0 211667±0.143961,疟原虫平均直径(A.M.D)为11.8350±1.84021μm;伯喹组单位面积(cm^2)红外期数为0.61425±0.35730,疟原虫平均直径为16.0418±4.8604μm,两组有显著性差异(P<0.05)。伯喹脂质体组与注射植物血凝素的伯喹脂质体组的抗疟效果未见提高。提示巨噬细胞活性的改变可影响伯喹脂质体的抗疟效果。

miR-128通过靶向p38调控树突细胞中IL-6的产生

p38 MAPK作为MAPK信号通路中关键的一类,对于树突细胞的成熟及激活等都具有至关重要的调节作用.首先利用生物信息学的方法预测了p38可能受到一系列microRNA的调控,进一步利用双荧光素酶报告载体系统证实了miR-128可直接作用于p38基因的3′非编码区域并抑制p38的表达.转染miR-128可以很显著地降低树突细胞中p38的蛋白水平,进而引起细胞因子IL-6分泌的减少.因此,利用miR-128可能是改善树突细胞抗肿瘤免疫治疗的一个新策略.

RGS1对RAW264.7细胞共刺激分子和细胞因子表达的调节

目的:研究RGS1基因对细胞表面分子表达以及细胞因子分泌的影响。方法:通过克隆RGS1基因、转染RAW264.7细胞、建立稳定转染的细胞系,利用流式细胞术检测,基因芯片分析初步探讨RGS1基因的功能。结果:RGS1基因能够抑制NF-κB转录因子活性;RGS1基因明显增加RAW264.7细胞表面CD86分子的表达,降低CD80表达;在不同Toll样受体配体刺激后,CD40、CD80和PD1水平低于对照组。同时,RGS1基因使IL-6、IL-15的表达明显升高,IL-10、IL-1的表达明显降低。结论:RGS1基因可调节免疫相关细胞表面分子和细胞因子的分泌,影响Toll样受体信号通路,表明RGS1可能在免疫调节方面起重要作用。

小鼠免疫抑制蛋白SOCS3脯氨酸富集区为其生物学功能所必需

SOCS3（suppressors of cytokine signaling 3）可以调节信号转导过程并影响造血干细胞的分化.利用生物信息学方法,发现SOCS3蛋白含有脯氨酸富集区,采用重组PCR技术缺失SOCS3蛋白中的129-161位的氨基酸（SOCS3Δ129-161）,并将其克隆到pcDNA31/V5质粒载体中.转染细胞,然后通过流式细胞技术,分析预测的功能区对SOCS3蛋白功能的影响.结果表明,此脯氨酸富集区对SOCS3蛋白的三级结构和功能有重要的意义.建模结果显示,SOCS3Δ129-161蛋白结构发生显著变化.脯氨酸富集区的缺失也影响小鼠骨髓细胞向CD8^＋T细胞分化.研究结果显示,SOCS3蛋白中129-161位的脯氨酸富集区在其结构和功能上有重要的作用.

髓系免疫抑制细胞的研究进展

早在20世纪初,人们就发现肿瘤的生长会伴随着髓系细胞的异常分化,这些细胞最初被描述为否决细胞、无效细胞或自然抑制（Natural suppressor,NS）细胞（[1]）,后期研究发现这些细胞能够抑制淋巴细胞的数目和细胞毒性T细胞的诱导与活性（[2]）。20世纪60年代,据报道肿瘤鼠的NS细胞能诱导类白血病反应,并且与肿瘤生长时间和髓系细胞浸润有关。

LPS刺激下miR-17和miR-20a对小鼠巨噬细胞CD80、CD86表达的影响

利用LPS刺激RAW264.7细胞,在不同的时间段检测到miR-17-5p和miR-20a表达水平的变化.利用基因克隆技术构建miR-17pcDNA3.1和miR-20a pcDNA3.1表达载体,利用电转的方法转染RAW264.7细胞,实时定量PCR方法检测RAW264.7细胞中miR-17和miR-20a的表达以确定转染率.LPS刺激4d后,进一步探讨miR-17和miR-20a对小鼠巨噬细胞表面抗原CD80和CD86表达的影响.结果显示,LPS刺激RAW264.7细胞检测到成熟miR-17-5p和miR-20a的表达先上升,至12h后表达开始下降,且克隆的miR-17pcDNA3.1和miR-20a pcDNA3.1质粒转染细胞后能产生成熟的miR-17-5p和miR-20a,LPS刺激CD80和CD86的上调能被miR-17和miR-20a抑制,说明miR-17和miR-20a能够调控抗原提呈细胞表面共刺激分子的表达.