阻断小鼠Mcl-1表达信号通路对BCG感染的影响

目的探讨下调Mcl-1表达信号通路对BCG感染的小鼠模型的影响。方法首先制备好BCG菌悬液感染BALB/c小鼠,再分别用调控Mcl-1表达的不同信号通路阻断剂腹腔注射感染小鼠模型,并同时设立对应的对照组,于处理后的1d、3d、5d、7d处死小鼠并收集腹腔巨噬细胞。应用TUNEL检测不同阻断剂在不同时间点处理后小鼠巨噬细胞凋亡率,细胞免疫化学分析不同阻断剂处理下Mcl-1的表达,HE染色和脏器指数分析不同阻断剂处理对小鼠脏器病变的影响。结果与对照组比,信号通路阻断剂处理后,BCG感染组巨噬细胞凋亡率均有不同程度的增高,其中PD98059处理组巨噬细胞凋亡率最高(F=40.621,P<0.001)。而且阻断剂PD98059处理后,巨噬细胞内BCG的菌落数量明显减少(t=3.392,P<0.001),小鼠肝、肺、脾、肾的病变程度明显减轻(F=59.24,F=811.134,F=34.091,F=9.543,P<0.05),脏器病理损伤也有所改善。结论应用阻断剂PD98059阻断Mcl-1表达信号通路可有效控制结核病的潜伏感染和持续感染。

抑制Mcl-1表达调控结核感染的小鼠腹腔巨噬细胞凋亡的机制初探

目的:应用Mcl-1-shRNA质粒抑制不同毒力结核分枝杆菌(MTB)菌株感染的小鼠腹腔巨噬细胞中Mcl-1的表达,通过观察Bcl-2和Bax表达的变化探讨其调控机制。方法:制备不同毒力MTB菌株悬液,分别感染BALB/c小鼠,再用Mcl-1-shRNA质粒处理感染小鼠模型,并同时设立对应的对照组,于处理后1 d、3 d、5 d和7d处死小鼠并收集腹腔巨噬细胞。应用流式细胞术检测不同处理时间、不同毒力菌株感染时小鼠腹腔巨噬细胞的凋亡率,real-time PCR和Western blot检测Bcl-2和Bax的表达。结果:Mcl-1-shRNA质粒处理后,不同毒力MTB菌株感染的小鼠巨噬细胞凋亡率均比对照组有不同程度的增高,其中以BCG和H37Ra组最明显(P <0. 05); Bcl-2的mRNA和蛋白水平显著减少,而Bax的mRNA和蛋白的表达均显著增加,以BCG感染组较为显著,且二者mRNA的比值与菌株毒力呈负相关(P <0. 05)。结论:抑制Mcl-1的表达可显著促进不同毒力MTB菌株感染的小鼠腹腔巨噬细胞凋亡,其调控机制可能与Bcl-2和Bax蛋白的表达及MTB菌株毒力密切相关。

Mcl-1表达信号通路阻断剂在H37Ra感染的小鼠模型中的作用

目的观察阻断髓样细胞白血病-1(Mcl-1)表达的信号通路对H37Ra感染小鼠的影响,从而探讨Mcl-1干预在此过程中的作用。方法制备好结核分枝杆菌H37Ra的菌悬液后,将其感染BALB/c小鼠,再用Mcl-1信号通路阻断剂AG490、PD98059、LY294002分别腹腔注射结核感染的小鼠模型,并同时设立相应的对照组。应用倒置显微镜观察巨噬细胞形态、TUNEL技术检测阻断剂应用后巨噬细胞的凋亡率、细胞免疫化学分析Mcl-1的表达、HE染色观察小鼠脏器的病理损伤变化。结果阻断剂处理后的H37Ra感染组凋亡率与空白对照组相比,均出现不同程度的升高,其中PD98059处理组凋亡率最高(P <0.05)。阻断剂PD98059处理后,H37Ra在巨噬细胞内的菌落数量明显减少,小鼠肝、肺、脾、肾的病理损害程度明显减轻(P <0.05)。结论阻断Mcl-1表达的信号通路可以显著促进结核感染的小鼠巨噬细胞的凋亡,减少结核杆菌在宿主巨噬细胞内的存活,减轻结核感染对小鼠脏器的病理损伤。而MAPK信号通路是此过程中调控Mcl-1表达的主要通路,且PD98059为其特异性抑制剂。

下调Bcl-2家族蛋白促进MTB感染的小鼠巨噬细胞系凋亡

目的探讨Mcl-1shRNA靶向下调Mcl-1的表达后,Bcl-2家族蛋白对不同毒力结核杆菌感染的小鼠Raw264.7巨噬细胞凋亡的调控作用。方法用XJ-MTB、H37Rv、H37Ra和卡介苗(BCG)感染小鼠Raw264.7巨噬细胞,并用Mcl-1 shRNA作用于感染的巨噬细胞,流式细胞术检测细胞凋亡率;Western blot检测Bcl-2家族蛋白Mcl-1和Bax的表达;实时荧光定量PCR检测Mcl-1、Bcl-2、Bax、caspase-3与细胞色素C mRNA的表达。结果 1)不同毒力的MTB感染可诱导小鼠Raw264.7巨噬细胞的凋亡,靶向下调Mcl-1的表达可显著提高XJ-MTB和H37Rv感染的宿主巨噬细胞的凋亡率。2)XJ-MTB和H37Rv感染可显著上调Bcl-2家族抗凋亡成员Mcl-1与Bcl-2的表达,应用Mcl-1 shRNA沉默Mcl-1基因后Mcl-1与Bcl-2水平显著下降,同时增高Bax的表达。3)不同毒力的MTB感染小鼠Raw264.7巨噬细胞后caspase-3和细胞色素C表达升高,靶向下调Mcl-1可以进一步上调感染组caspase-3和细胞色素C的表达。结论 MTB感染后小鼠Raw264.7巨噬细胞中Bcl-2家族蛋白与基因的表达水平与菌株毒力相关,应用Mcl-1shRNA下调Mcl-1的表达可以促进宿主巨噬细胞的凋亡。

下调Mcl-1表达对H37Rv感染小鼠模型调控作用研究

目的用不同阻断剂下调调控抗凋亡蛋白Mcl-1表达信号通路,探讨下调Mcl-1表达对结核杆菌感染小鼠腹腔巨噬细胞凋亡和炎症反应的影响。方法制备结核分枝杆菌国际标准强H37Rv菌株菌悬液,感染BALB/c小鼠,再分别腹腔注射Mcl-1信号通路阻断剂AG490、PD98059、LY294002,同时设立对应的对照组。应用ELISA筛选不同阻断剂处理小鼠的最佳剂量,采用TUNEL试剂盒检测阻断剂应用后小鼠腹腔巨噬细胞凋亡率,透射电镜观察阻断剂应用后宿主巨噬细胞的形态学变化,HE染色分析应用阻断剂后小鼠肝、肺、脾、肾脏器的病理损伤情况。结果阻断剂处理H37Rv感染组小鼠巨噬细胞凋亡率与空白对照组均有不同程度的增高,其中PD98059处理组显著高于其他处理组(P<0.05);阻断剂PD98059处理组小鼠巨噬细胞感染H37Rv数量明显减少,且出现核固缩和凋亡。H37Rv感染小鼠肝、肺、脾、肾脏器出现严重病理损伤,而阻断剂应用后的病理损害程度明显减轻(P<0.05)。结论应用阻断剂下调Mcl-1的表达可促进结核杆菌感染小鼠腹腔巨噬细胞的凋亡,减少巨噬细胞内潜伏H37Rv数量,减轻结核感染对小鼠脏器的病理损伤。作用效果以MAPK信号通路阻断剂PD98059强于JAK/STAT和PI3K信号通路阻断剂AG490和PD98059。

结核分枝杆菌PhoP蛋白的生物信息学分析

目的应用生物信息学软件预测结核分枝杆菌PhoP基因编码蛋白的结构和功能。方法从NCBI数据库获取PhoP基本的基因信息及其编码序列氨基酸信息;应用ProtParam软件预测PhoP蛋白的理化性质;利用SignalIP4.1和TMHMM分析其信号肽和跨膜区;利用在线分析Expasy工具分析蛋白二级结构,建立蛋白三级结构模型;采用Bepipred 1.0Server和SYFPEITHI分析蛋白的B细胞及T细胞抗原表位。结果 PhopP蛋白共250个氨基酸,分子式为C1226H1974N346O364S4,原子总数3 914,半衰期为30h,预测该蛋白为稳定性亲水性蛋白;二级结构中α-螺旋、β-转角、β-折叠、无规则卷曲分别占36.03%、10.58%、24.7%和27.94%,预测的B细胞、CTL细胞抗原表位分别为21个和7个;PhoP基因与天蓝色链霉菌同源性较高;其编码蛋白的相互作用蛋白为PhoR、senX3、trcS等。结论生物信息学分析PhoP为稳定蛋白,且含有潜在的B、T细胞抗原表位,是结核病诊断及治疗的潜在候选因子。