马铃薯甲虫热激蛋白基因Ld-hsp70的克隆及温度胁迫下的表达特性

【目的】热激蛋白(heat shock protein,HSP)是一种在生物体内广泛存在且高度保守的蛋白质,在生物抗逆过程中发挥重要作用。当生物体遭受不利环境条件胁迫时,其迅速产生可保证生物体的正常生理活动。本研究以重大检疫害虫马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)为研究对象,对其热激蛋白HSP70基因(Ld-hsp70)进行克隆,并对其在温度胁迫下的表达特性进行分析,明确HSP70在马铃薯甲虫温度胁迫中的作用。【方法】基于NCBI数据库检索筛选马铃薯甲虫HSP70的cDNA序列,利用RT-PCR和RACE技术对Ld-hsp70的全长cDNA进行克隆;利用DNAMAN软件对其全长序列进行拼接;采用生物信息学方法对Ld-hsp70及其编码氨基酸的序列特性进行分析;使用MEGAX软件的邻接法(neighbor-joining,NJ)构建马铃薯甲虫HSP70与其他昆虫HSP70的系统进化树;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术对Ld-hsp70在不同温度胁迫条件下的表达模式进行分析;利用Primer 5.0软件设计试验所用的特异性引物。【结果】基于NCBI数据库获得3类马铃薯甲虫HSP70 cDNA序列,分别命名为HSP70a、HSP70b和HSP70c,经克隆、拼接获得其全长序列,分别命名为Ld-hsp70a、Ld-hsp70b和Ld-hsp70c,GenBank登录号分别为KC544268、KC544269和KC544270。序列分析表明,3个Ld-hsp70编码的氨基酸序列均包含了完整保守结构域和3段保守的HSP70家族签名序列,且在氨基酸C末端具有保守的亚细胞定位基序。Ld-hsp70a和Ld-hsp70c的氨基酸C末端具有保守基序EEVD,属于胞质型热激蛋白;Ld-hsp70b的氨基酸C末端具有保守基序KDEL,属于内质网型热激蛋白。系统进化树分析显示,Ld-hsp70a和Ld-hsp70b与其他物种的HSP70分别聚为一支,Ld-hsp70c与已报道的马铃薯甲虫HSP70聚为一支。其中,Ld-hsp70a与龟纹瓢虫(Propylaea japonica)的Pj-hsp70,Ld-hsp70b与稻水象甲(Lissorhoptrus oryzophilus)的Lo-hsp70,Ld-hsp70c与大猿叶甲(Colaphellus bowringi)的Cb-hsp70同源性最高。qRT-PCR结果表明,高、低温均能诱导马铃薯甲虫雌、雄成虫的3个Ld-hsp70的表达。不同温度胁迫处理1 h后,马铃薯甲虫雌、雄成虫体内3个Ld-hsp70的相对表达量未见显著变化;而4 h后,马铃薯甲虫雌、雄成虫Ld-hsp70a的相对表达量与对照相比分别在低温-10℃和高温44℃时显著上调至2.24和2.41倍,Ld-hsp70b和Ld-hsp70c相对表达量在胁迫4 h后与对照相比差异均不显著。另外,无论是雌虫还是雄虫,3个Ld-hsp70的相对表达量在同一温度不同的胁迫处理时间之间均无显著差异。【结论】Ld-hsp70a可以响应高、低温胁迫,可能在马铃薯甲虫抵御温度胁迫中发挥作用,而Ld-hsp70b和Ld-hsp70c对高、低温均不敏感,表明马铃薯甲虫3个Ld-hsp70在抗温度胁迫中发挥不同的作用。

麦长管蚜miRNA实时荧光定量PCR内参基因的筛选

【目的】筛选特定条件下麦长管蚜Sitobion avenae稳定表达的微小RNA(miRNA)表达分析内参基因。【方法】根据麦长管蚜miRNA Illumina测序结果筛选出miR-10-3p,miR-993,miR-276,miR-275,miR-252a,miR-1,miR-375,pc-15,pc-73和1个常用内参基因U 6共10个候选内参基因。利用qRT-PCR测定10个候选内参基因在麦长管蚜有翅蚜和无翅蚜不同发育时期、不同组织以及4种化学药剂(95.1%吡虫啉原药、97.8%噻虫啉原药、95%阿维菌素原药和40%氧乐果乳油)处理无翅蚜中的相对表达量。利用GeNorm,NormFinder,ΔCt法,BestKeeper和RefFinder对10个候选内参基因的表达稳定性进行评价。【结果】qRT-PCR结果表明,在麦长管蚜有翅蚜不同发育阶段、无翅蚜不同发育阶段、有翅蚜和无翅蚜不同组织中和4种药剂处理的无翅蚜中表达量较高的内参基因分别是miR-276,miR-276,miR-10-3p和miR-10-3p;5种方法综合分析得出,在上述4种条件下表达稳定性都较好的内参基因分别是miR-252a,miR-993,miR-275和miR-993。GeNorm软件分析表明不同条件下麦长管蚜内参基因的较佳数目为2,结合RefFinder稳定性综合排序的结果分析可知在有翅蚜不同发育阶段、无翅蚜不同发育阶段、有翅蚜和无翅蚜不同组织中和不同药剂处理无翅蚜中稳定表达的内参基因组合分别是miR-252a和miR-276,miR-993和miR-276,miR-275和miR-10-3p,miR-993和miR-10-3p。【结论】麦长管蚜有翅蚜不同发育阶段、无翅蚜不同发育阶段、有翅蚜和无翅蚜不同组织中和不同药剂处理无翅蚜中内参基因优化组合分别为miR-252a和miR-276,miR-993和miR-276,miR-275和miR-10-3p,miR-993和miR-10-3p。研究结果为麦长管蚜miRNA基因定量表达的研究提供了内参基因选择的依据。

昆虫性信息素研究进展与应用前景

昆虫性信息素是由性成熟的个体产生和释放,能引诱或激起同种异性个体进行交尾的微量化学物质。由于昆虫性信息素具有微量、高效、灵敏度高、对天敌无害、对环境友好等特点,目前已广泛应用于虫情监测、干扰交配、害虫检疫及大量诱杀等方面。近年来,随着性信息素分析技术的改进,检测仪器的多样及灵敏度的提高,针对昆虫性信息素的研究不断拓展和深化。本文在广泛调研国内外大量文献的基础上,综述了昆虫性信息素的生物学研究概况、性信息素的结构特点、提取方法、鉴定方法、化学合成以及其在调控害虫行为方面的应用等领域的研究进展,并对其应用前景进行了展望,旨在为昆虫性信息素的研发与应用提供技术参考和理论依据。