牛支原体灭活疫苗免疫程序及母源抗体消长规律研究

为评价不同剂量的自主研发牛支原体灭活氢氧化铝佐剂疫苗对怀孕母牛免疫后抗体消长规律和免疫效果,本试验选择产前30~15d围产母牛70头,随机分为7组,每组10头牛,间隔15d,采用不同剂量免疫,定期采集初乳和犊牛血清,采用已建立的牛支原体间接ELISA检测方法检测初乳乳清和犊牛血清中的抗体滴度,统计分析其抗体消长规律。结果表明,使用自主研发牛支原体灭活氢氧化铝佐剂疫苗免疫怀孕母牛无红肿、发热等症状,是安全可靠的;用不同剂量疫苗免疫怀孕母牛,初乳乳清抗体中牛支原体Ig G抗体水平在奶牛分娩后3h达到一个峰值,随着奶牛产后时间的延长抗体水平呈逐步下降,在奶牛产后96h,抗体值均在0.3以下;A组的抗体最低,B组、C组、D组抗体均低于E组和F组;E组和F组抗体滴度较高,两者无差异。不同剂量疫苗免疫母牛所产犊牛哺食初乳后,犊牛血清中牛支原体Ig G抗体在犊牛出生后24h达到最高,随着犊牛日龄的增加,抗体滴度呈现逐步下降趋势;在A组、B组和C组抗体呈现层次不齐的状况,D组抗体水平高于A组、B组、C组,低于E组和F组;E组和F组抗体水平较高,且维持时间较长。研究结果为牛支原体疫苗的免疫程序制定提供了科学依据。

致犊牛肺炎牛支原体南疆株的分离鉴定及oppF基因序列分析

本研究旨在调查新疆喀什某规模化奶牛场的犊牛死亡原因,并确定病原体。无菌采集3份因肺炎死亡的犊牛肺脏病料样品。采用牛支原体专用液体培养基和1.0%牛支原体琼脂固体筛选培养基从3份病死犊牛肺脏病料中分离得到2株牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis),分别命名为M.bovis-NJ-1和M.bovis-NJ-2。通过菌落形态学观察、特异性PCR和oppF测序比对对分离株进行鉴定。结果显示,2个分离株在固体培养基上的菌落呈现典型的"煎蛋状",且Dienes染色特点符合牛支原体菌落着色特征,中心呈深蓝色;PCR能扩增出牛支原体特异的448bp目的片段;2个分离株的oppF基因序列与牛支原体国际标准株PG45的同源性分别为96.7%和95.3%。结果表明,引起犊牛发病死亡的病原是牛支原体,本研究为犊牛支原体肺炎的快速诊断和防制提供依据。

牛支原体灭活疫苗免疫小鼠最小免疫剂量及抗体消长规律研究

[目的]对小白鼠进行最小免疫剂量及抗体消长规律初步研究。[方法]采用课题组制备的牛支原体灭活氢氧化铝佐剂疫苗,分别以0.1 mL/只·天、0.2 mL/只·天、0.3 mL/只·天、0.4 mL/只·天的不同剂量,注射小白鼠腿部肌肉。[结果]最小免疫剂量为0.2 mL/只;免疫3周后抗体滴度达到最高峰,随后抗体滴度开始逐步下降,但仍保持相对稳定,抗体滴度维持在0.319的较高水平,5周后抗体滴度表现明显下降趋势。[结论]本试验为后期牛支原体灭活疫苗在牛群中进行试验研究奠定了基础。

牛支原体(新疆株)灭活疫苗的制备及犊牛免疫保护性评价

为研发用于预防犊牛支原体肺炎及关节炎灭活油佐剂疫苗并评价其免疫效果,本研究采用牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)新疆分离株做为制苗菌株,经牛支原体专用液体扩大培养基培养后进行膜分离浓缩、甲醛灭活,加入油佐剂乳化制备牛支原体灭活疫苗,经无菌检验、实验动物安全性检验及乳化效果检测后进行犊牛免疫效果测定。结果显示,免疫组犊牛在二免后14 d,血清中M.bovis抗体达到0.465(OD_(450)),3头攻毒犊牛均保持良好的精神状态且体温变化不明显,临床症状综合评分为3,肺脏解剖学及病理组织学观察无异常,肺脏病变指数为2且肺脏中未分离回收到M.bovis;未免疫对照组犊牛同期血清M.bovis抗体为0.142(OD_(450)),3头攻毒犊牛均先后出现体温升高、轻度咳喘、脓性鼻液、明显消瘦等症状,临床症状综合评分为11,肺脏病变指数为17,肺脏尖叶、心叶及部分膈叶均表现明显肝变,2头犊牛表现胸膜与肺脏黏连,1头犊牛整个尖叶广泛分布黄白色蚕豆状大小坏死性结节,与自然感染病例相同,病理组织学观察显示肺泡腔和支气管中有大量中性粒细胞浸润,支气管管壁充血、水肿,肺脏部分坏死灶呈均质红染,为典型的化脓性及坏死性肺炎变化,从病变肺组织中均分离回收到M.bovis。结果表明,本研究制备的牛支原体灭活疫苗给犊牛免疫后能产生良好的免疫应答反应,并能抵抗M.bovis感染所致的肺脏病变作用。

环境因子及接种量对单增李斯特菌生长的影响

为探究不同环境因子及接种量对单增李斯特菌(LM90)生长特性的影响,本试验通过测定LM90在各培养条件下的D600nm值,分析了不同的温度、NaCl浓度、pH,以及温度(0~40℃,梯度为10℃)、NaCl浓度(3%~8%,梯度为1%)、pH(6~9,梯度为1)的交互作用下LM90的生长状况。结果显示,菌株的对数增长期为8~16h,稳定期为16~20h,20h以后进入衰亡期;菌株在NaCl浓度为0.5%~4%时生长良好,其最适生长pH为7.5,最适生长温度为37℃。通过SPSS 20.0软件进行方差分析可知,各因素的交互作用均对LM90有极显著影响(P<0.01)。本研究为进一步探讨温度、NaCl浓度、pH等因素对LM生长的影响及LM抗环境胁迫的作用机制奠定了基础。

单增李斯特菌(LM90)inlA单基因及inlB/inlA双基因缺失株的构建及其生物学特性初步研究

为探究内化素inlA、inlB基因缺失对单核细胞增生性李斯特菌(LM)生物学特性的影响,本研究采用同源重组技术构建了inlA基因缺失株(LM90-inlA)和inlB、inlA双基因缺失株(LM90-ΔinlB/ΔinlA),并对其生物学特性进行了初步研究。结果显示:PCR和测序结果证实成功构建了目的基因(inlA、inlB)缺失株;菌落PCR和测序结果显示2种缺失株在体外连续培养20代过程中均能稳定遗传;生长特性实验表明2种缺失株与亲本株生长差异无统计学意义(t_(LM90/LM90-ΔinlA=0.34),p>0.05;t_(LM90/LM90-ΔinlB/ΔinlA)=0.324,p>0.05;t_(LM90-ΔinlA/LM90-ΔinlB/ΔinlA)=0.008,p>0.05)且inlA缺失后2缺失株对小鼠的LD_(50)分别升高了0.64、1.26个对数数量级。研究结果表明inlA基因和inlB基因对LM90的部分生物学特性具有一定的调控作用,这对于阐明LM毒力因子的致病机理提供了参考依据,也为研究内化素介导LM穿越血脑屏障(BBB)的作用机制奠定了科学基础。

致肉牛运输热溶血曼氏杆菌的分离鉴定及部分生物学特性研究

为探明一起肉牛运输热的病原及生物学特性,本研究无菌采集病死牛心血、肺脏、肝脏和脾脏,对其进行细菌分离、生化试验和PCR鉴定,并对分离株进行毒力基因检测、致病性研究。结果显示,7株分离菌均为革兰氏阴性短杆菌,具有微弱的β-溶血,瑞氏染色可见两极浓染及明显的荚膜。生化试验结果显示,分离菌能发酵葡萄糖、麦芽糖、阿拉伯糖、甘露醇、甘露糖、木糖等碳水化合物,不发酵脲酶、MR-VP和吲哚,产生少量酸而不产气,结果符合溶血曼氏杆菌生化特性。PCR鉴定均为荚膜血清A2型,分离菌均含有四型菌毛相关基因ptfA、参与复制相关基因dnaN、白细胞介素相关基因LktC3种毒力基因。分离菌对小鼠的LD50值在107.83～108.50 CFU/mL之间,不同菌株间小鼠LD50值存在一定差异,但差异不明显。结果表明,引起该批肉牛运输热的病原为携带毒力基因的荚膜血清A2型溶血曼氏杆菌,本研究结果为进一步研究溶血曼氏杆菌的致病机制提供参考。

食源性单增李斯特菌inlA/inlB/inlC基因缺失株的构建及其生物学特性分析

为探究内化素inlA/inlB/inlC基因对单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)生物学特性的影响,本研究采用融合PCR方法构建Lm681 inlC基因缺失突变体,并构建pKSV7-△inlC穿梭载体,将其转化Lm681-△inlAB感受态细胞,利用温度(42℃)和氯霉素(10μg/mL)抗性双重压力来实现同源重组,筛选同源重组子进行鉴定并研究其部分生物学特性。结果显示,PCR和测序结果证实成功构建了3基因缺失株(Lm681-△inlABC),且缺失株的生长特性与野生株相比无明显差异,溶血特性与野生株保持一致;小鼠感染试验显示,野生株Lm681、Lm681-△inlAB和Lm681-△inlABC对小鼠的致死率分别为80%(8/10)、60%(6/10)和40%(4/10),对小鼠的LD50分别为4.36×10~4、1.35×10~6和2.95×10~7 CFU,且Lm681-△inlABC在肝脏、脾脏及脑组织中的定植能力极显著低于野生株(P<0.01)。研究结果表明,inlA/inlB/inlC基因对Lm致病性发挥具有一定的作用,为深入研究inlX基因介导Lm入侵宿主细胞过程中的作用机制提供了科学依据。

单增李斯特菌inl A/inl B双基因缺失株生长特性观察及对小鼠致病性研究

目的探究单增李斯特菌inl A/inl B双基因缺失株的生物学特性。方法通过体外胁迫培养条件下OD600测定以及小鼠感染试验,对Lm90-△inlAB和Lm90的抗胁迫能力及细菌致病力进行研究。结果低温(4℃、30℃)环境下,Lm90和Lm90-△inlAB生长差异无统计学意义(t4℃=0.057,P>0.05;t30℃=0.441,P>0.05),适温37℃及42℃高温环境下,Lm90-△inlAB较Lm90生长受到抑制,生长差异具有统计学意义(t37℃=0.763,P<0.05;t42℃=1.147,P<0.05);体外耐酸碱试验中,Lm90-△inlAB耐酸性未明显改变,而耐碱能力强于亲本株Lm90,生长差异具有统计学意义(pH=9时t=2.837,P<0.05);在含有3.5%酒精的BHI培养基及含5%NaCl高渗BHI培养基中,Lm90-△inlAB增长趋势明显低于Lm90,生长差异具有统计学意义(t酒精=1.422,P<0.05;tNaCl=1.382,P<0.05),Lm90-△inlAB对酒精及高盐的耐受力显著低于Lm90;小鼠毒力测定结果表明,Lm90-△inlAB与Lm90半数致死量分别为106.94 CFU、105.68 CFU,Lm90-△inlAB毒力下降明显,在不同检测时间点Lm90-△inlAB在小鼠肝脏和脾脏内的载菌量均少于Lm90,载菌量差异具有统计学意义(t肝=2.454,P<0.05;t脾=2.443,P<0.05)。结论 Lm的抗胁迫能力可能随着基因的缺失发生显著改变,内化素InlA/InlB与单增李斯特菌侵染宿主的能力有一定的调控作用。缺失株生物学特性测定对研究Lm胁迫环境生存及毒力因子的致病机理提供了科学依据。

牛支原体新疆分离株P48基因的克隆、原核表达及重组蛋白免疫原性研究

试验旨在确定牛支原体P48基因的免疫原性,为进一步筛选牛支原体免疫保护性基因奠定基础。本研究以牛支原体新疆分离株为研究对象,运用Overlap PCR方法扩增得到点突变后的牛支原体新疆分离株P48基因,构建原核表达载体pET-32a(+)-P48,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,在诱导剂ITPG的诱导下获得重组蛋白P48,纯化后的重组P48蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,运用Western blotting和ELISA方法验证其反应原性和免疫原性。结果表明,试验成功构建原核表达载体pET-32a(+)-P48,重组蛋白P48大小约为66ku,纯化后的牛支原体P48重组蛋白免疫小鼠后可产生良好的免疫反应,血清抗体滴度达到较高水平(D450nm值为1.126)。Western blotting结果显示,抗牛支原体P48重组蛋白的鼠血清与牛支原体P48重组蛋白及牛支原体全菌蛋白抗原均能产生明显的抗原抗体反应,表明P48重组蛋白具有良好的免疫原性与反应原性,可作为牛支原体新型疫苗的候选基因,且牛支原体新疆分离株P48基因与国内外5株牛支原体P48基因的同源性很高,亲缘关系较近。

抗犊牛肺炎支原体免疫初乳乳清的制备

为探讨抗犊牛肺炎支原体免疫初乳乳清的制备方法,本试验采用牛支原体灭活佐剂疫苗于经产前2-4周给怀孕母牛免疫接种2次,制备高免初乳,收集产后12h之内的初乳,分别采用离心沉淀与过滤法制备脱脂初乳,采用不同的酸化法、酶化法、酸和酶结合法制备乳清,通过紫外分光光度计及ELISA方法检测乳清中的总蛋白含量及抗牛支原体抗体滴度。结果显示,4℃、3500r/min离心30min对初乳的脱脂效果最好,初乳总蛋白含量及抗牛支原体抗体滴度损失最少;酶和酸结合法的乳清析出率最高,维生素C（0.2g/mL）处理法对脱脂初乳中蛋白损失最小,盐酸处理法对脱脂初乳中抗牛支原体抗体滴度损失最小。结果表明用0.6mol/L盐酸调pH至4.6,室温下放置30min,10000r/min离心20min是高免初乳乳清制备的适宜方法。

牛瘤胃乳酸菌的分离与鉴定

为分离筛选用于生活菌制剂的乳酸菌菌株,试验采用API 50CHL对从牛瘤胃中分离的60株乳酸菌进行生化鉴定,对鉴定出的菌株进行耐酸耐碱、生长温度、耐氧、耐药和抑菌性测定。结果显示,经生化鉴定出的3株菌分别为嗜酸乳杆菌（L.acidophilus）、发酵乳杆菌（L.fermentum）和乳明串珠菌（L.holzapfelii）,分别命名为L1、L2和L3。其中,L1耐酸性最强,L2耐碱性最强,L1在37-40℃之间均生长良好且兼性厌氧;L1、L2、L3耐药率为60%-100%;3株乳酸菌对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有不同程度的抑制作用,其中L1抑菌效果最好,抑菌圈直径分别为18.30和16.40mm。提示,L1、L2可作为抗性乳酸菌活菌制剂的候选菌株。

致萨福克羊呼吸道感染绵羊肺炎支原体的分离鉴定

对新疆昌吉地区某规模化羊场的疑似绵羊肺炎支原体(MO)感染的病料进行病原分离鉴定,本研究采用羊支原体专用液体培养基和1.0%羊支原体琼脂固体筛选培养基从2份病死羔羊肺脏和13份患病羔羊鼻试子分离得到9株支原体,通过菌落形态学观察,生化试验及特异性PCR方法进行鉴定。结果显示:分离株菌落呈"煎蛋状",Dienes染色菌落中心呈深蓝色,符合支原体菌落染色特征;分离株能发酵葡萄糖,不能水解精氨酸,不分解尿素,明胶液化反应阴性,美兰还原反应阳性符合MO生化特性;参照MO16S r RNA序列进行PCR鉴定,9株培养物均扩增出大小为406 bp的目的片段;生物信息学分析显示,9个分离株与参考株Y98核苷酸同源性均在75%以上,结果表明这9株分离株均为MO,从而确定引起该羊场绵羊呼吸道感染的病原体为MO。本研究结果可为该场绵羊呼吸道病的防控提供诊断依据。

锁钥自组装的研究进展

锁钥自组装(lock-and-key self-assembly)是制备复杂胶体的一种方法,本文简单介绍了锁钥自组装技术的研究背景,详细总结了锁钥自组装的排空相互作用和特点。其中,通过自洽场理论、接受比率法和密度泛函理论介绍了排空相互作用;通过与其他自组装比较,说明锁钥自组装具有特异性识别、自组装可控制和操作简单等优点;最后对锁钥自组装方法进行了总结与展望。

抗牛多杀性巴氏杆菌高免卵黄抗体IgY的制备及间接血凝检测方法的建立

本研究通过自制牛源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌灭活菌苗免疫产蛋鸡,采用卡拉胶结合硫酸铵沉淀法提取卵黄抗体IgY,并采用间接血凝方法检测抗体效价。结果表明,抗原致敏红细胞的最佳浓度是800μg/mL,免疫后第7周抗体效价达到高峰,效价为1:1024,高效价持续5周开始下降,测定提取的IgY浓度为8.258mg/mL,无菌检测及动物安全性实验表明制备的卵黄抗体安全可靠。本研究制备了抗牛多杀性巴氏杆菌卵黄抗体,为防治由荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌所致的犊牛肺炎提供了新的手段。

抗牛支原体及多杀性巴氏杆菌二联卵黄抗体的制备及初步临床应用观察

本研究将自制牛支原体和牛源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌灭活菌苗分别免疫产蛋鸡,并检测效价,采用卡拉胶结合硫酸铵沉淀法提取Ig Y,观察抗牛支原体及多杀性巴氏杆菌二联高免卵黄抗体制剂在犊牛中应用的效果,并进行临床应用研究。结果显示,牛支原体在首免后第60d抗体效价达到高峰,经ELISA检测效价为1:128000;牛多杀性巴氏杆菌首免后第50d抗体效价达到高峰,经IHA检测效价为1:1024。临床初步应用表明,二联卵黄抗体对犊牛肺炎的预防和治疗均有一定作用。

卷曲形绿茶机制加工工艺试验研究

探索卷曲形绿茶机制加工工艺,筛选得到其机制加工工艺最佳流程为:鲜叶—摊放—滚筒杀青—揉捻—烘干做形提毫。

加快莲都茶产业化发展的思考

论述莲都区茶产业现状及发展的基础和条件,指出茶产业化建设中存在的问题,提出加快茶产业化发展的思考,以期促进当地茶产业的发展。

牛瘤胃乳酸菌的分离与鉴定

为分离筛选用于牛活菌制剂的乳酸菌菌株,本试验采用API 50CHL对从牛瘤胃中分离的60株乳酸菌进行生化鉴定,对鉴定出的菌株进行耐酸、耐碱、耐氧、生长温度、耐药和抑菌性测定。结果显示,经生化鉴定出的3株乳酸菌分别为嗜酸乳杆菌（L.acidophilus）、发酵乳杆菌（L.fermentum）和乳明串珠菌（L.holzapfelii）,分别命名为L1、L2和L3。其中,L1耐酸性最强,L2耐碱性最强,L1在37-40℃均生长良好且兼性厌氧;L1、L2、L3耐药率分别为80%、67%、53%;3株乳酸菌对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有不同程度的抑制作用;L1抑菌效果最好,抑菌直径为18.3mm和16.4mm。结果表明,L1、L2可作为抗性乳酸菌活菌制剂的候选菌株。