人miR-16真核表达载体的构建与鉴定

目的构建人miR-16真核表达载体,为研究其基因表达调控机制建立实验基础。方法从人类基因组DNA中扩增miR-16的前体序列,引入酶切位点和polyT转录终止序列,酶切后插入siRNA表达载体pSuper中,构建miR-16真核表达载体pmiR-16,然后进行酶切和测序鉴定;同时构建含miR-16完全互补序列及乙肝表面抗原HBsAg的报告质粒pXF3H-HBs。将pmiR-16与pXF3H-HBs共转染肝癌细胞系HepG2,通过HBsAg ELISA检测试剂盒检测表达产物HBsAg的改变,鉴定真核表达载体pmiR-16的生物学活性。结果成功构建了人miR-16真核表达载体pmiR-16及其报告质粒。pmiR-16与pXF3H-HBs共转染HepG2后,pmiR-16组HBsAg的基因表达与对照组相比显著降低,证实pmiR-16转染真核细胞后具有生物学活性。结论miR-16真核表达载体的成功构建为进一步研究其基因表达调控机制建立了实验基础。

2023年广东省急性出血性结膜炎流行末期病原组成及基因进化分析

分析2023年广东省急性出血性结膜炎(Acute hemorrhagic conjunctivitis,AHC)疫情流行末期病原体组成及其分子特征情况,为AHC的防治提供科学依据。本研究采集AHC流行末期81份AHC患者眼结膜拭子,采用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qPCR)方法,对其进行人肠道病毒70型(Human enterovirus 70,HEV70)、柯萨奇病毒A组24型变异株(Coxsackievirus A24 variant,CVA24v)和腺病毒(Adenovirus,AdV)核酸检测。通过HEp-2细胞进行病毒分离。对分离株进行PCR扩增和基因测序。用Mega11和BioEdit软件进行基因进化分析,用SWISS-MODEL进行VP1蛋白三维结构分析,通过IEDB进行VP1蛋白的B细胞抗原表位预测。结果显示81份眼拭子样本荧光定量PCR检测,EV70全部阴性,20份样本CVA24v阳性,16份样本AdV阳性。使用HEp-2细胞成功分离到8株CVA24v毒株。基于分子测序分析发现,2023年AHC流行末期的CVA24v病毒株与5月份疫情初期病毒株相比,8株CVA24v毒株在3C区核苷酸共有7处突变,其中在第309位点共享同义突变C→T。在VP1区共有19处突变,除AHC705/GD/CHN/2023株外,其余7株在第30位点共享同义突变T→C。此外还获得一株CVA24v的全基因组序列,和流行初期病毒株全长序列相比有24个核苷酸突变,3个氨基酸突变。本研究通过分析VP1蛋白的三维结构预测,识别出了本次疫情流行末期相比早期出现三个变异位点,其中T98A和A146T两个位点位于蛋白表面,参与组成抗原决定簇。研究结果显示,与疫情初期由CVA24v独立引起的流行相比,流行末期出现了CVA24v与AdV共同流行的现象。这一发现对理解病毒变异与流行动态具有重要意义。