Sh-PLCε提高IL-2治疗肾癌疗效的研究

该实验旨在探讨磷脂酰肌醇特异性磷脂酶Cε(phospholipase Cε,PLCε)是否在白介素2(interleukin 2,IL-2)治疗肾癌的过程中发挥一定的作用。采用sh-PLCε慢病毒转染肾癌细胞株786-o。MTT法检测IL-2处理肾癌细胞最适浓度,使用最适浓度IL-2处理细胞。流式细胞术检测细胞凋亡。DAPI染色观察细胞中凋亡小体。q-PCR、Western blot检测Fas/FasL以及Fas下游相关分子在基因水平以及蛋白水平的表达变化。将肿瘤细胞与淋巴细胞进行共培养,流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果显示,敲低PLCε后,Fas/FasL表达降低,而IL-2处理后,会逆转这种效果。检测Fas下游相关通路后发现,IL-2处理阴性对照(negative control,NC)组后,Fas下游凋亡抑制信号通路FADD/cFlip/Traf2启动,IL-2处理sh-PLCε组后,Fas下游凋亡信号通路FADD/Caspase8/Caspase3启动。共培养实验后流式细胞术结果显示,IL-2处理与sh-PLCε联用组细胞凋亡比例最高。该实验证明,sh-PLCε可以通过启动Fas下游凋亡信号通路,抑制凋亡抑制信号通路来提高IL-2治疗肾癌的疗效。

miR-199b-3p通过靶向PLCε抑制前列腺癌细胞的恶性增殖

该研究的目的是确定miR-199b-3p在前列腺癌(PCa)中的表达及其对PCa细胞增殖的影响及作用机制。通过实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测miR-199b-3p在PCa组织、良性前列腺增生(BPH)组织、PCa细胞及人正常前列腺上皮细胞(RWPE-1)中的表达,并分析其表达与PCa临床病理特征的关系。蛋白质印迹法(Western blot)用于检测磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C epsilon(PLCε)的表达。采用CCK-8法和克隆形成实验对其体外增殖进行评估。Edu测定法用于检测细胞对Edu的吸收。荧光素酶报告实验被用来验证miR-199b-3p和PLCε的靶向结合情况。结果显示,在PCa组织中miR-199b-3p的表达水平明显低于BPH组织,且与临床病理特征中的组织学分期相关。上调miR-199b-3p可以显著抑制PCa细胞的增殖和Edu的摄取能力,PLCε被鉴定为miR-199b-3p的下游靶基因,且其表达量与miR-199b-3p的表达量呈负相关。此外,补救实验结果显示,上调PLCε能够逆转miR-199b-3p在PCa细胞增殖中的抑制作用。总之,miR-199b-3p可通过靶向PLCε3′非编码区(3′-UTR)负性调控PLCε进而抑制PCa细胞的恶性增殖。

PLCε通过GLS/p-mTOR途径促进膀胱癌细胞T24生存

谷氨酰胺对于细胞的代谢和生长十分重要,也是血液中含量最丰富的氨基酸,且肿瘤的代谢特征之一就是谷氨酰胺成瘾。该研究探讨磷脂酰肌醇特异性磷脂酶PLC epsilon(phospholipase C epsilon,PLCε)是否通过谷氨酰胺酶(glutaminase,GLS),调节膀胱癌细胞T24自噬,促进膀胱癌细胞生存。首先通过数据库Su Multi-cancer Statistics、Sanchez-Carbayo Bladder 2和细胞实验分析PLCε在膀胱癌中表达情况。结果表明,PLCε在膀胱癌中高表达。并通过LV-shPLCε转染膀胱癌细胞T24后,q-PCR和Western blot检测PLCε在膀胱癌细胞T24中的表达情况以及对凋亡和自噬的影响,同时免疫荧光检测细胞内自噬斑点(LC3)的变化。结果显示,敲低PLCε后,Caspase-3/Caspase-8/LC3-Ⅱ表达增加,p62表达降低;流式细胞术结果显示凋亡率增高;免疫荧光发现自噬斑点LC3均增多;GLS和p-mTOR的表达受到抑制。在shPLCε组中添加过表达GLS质粒后,p-mTOR和p62表达增加,LC3-Ⅱ表达降低并且免疫荧光自噬斑点LC3减少;加入敲低GLS质粒后出现相反结果。该研究得出,PLCε通过GLS/p-mTOR抑制膀胱癌细胞T24自噬,促进膀胱癌细胞T24的生存。

shPLCε通过YAP抑制前列腺癌细胞的丝氨酸/甘氨酸代谢和增殖

目的:该研究旨在探讨磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C epsilon(phospholipase C epsilon,PLCε)对前列腺癌细胞丝氨酸/甘氨酸代谢及细胞增殖的影响。方法:慢病毒及质粒转染LNCAP、PC3细胞,q-PCR、Western blot分别检测LNCAP、PC3细胞中PLCε、Yes相关蛋白(yes associated protein,YAP)、丝氨酸/甘氨酸生成酶[包括磷酸丝氨酸转氨酶1(phosphoserine aminotransferase1,PSAT1)、磷酸丝氨酸磷酸酶(phosphoserine phosphatase,PSPH)、丝氨酸羟甲基转移酶2(serine hydroxymethyltransferase2,SHMT2)及增殖相关基因细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)]的表达情况;克隆形成实验及MTT实验检测细胞的克隆形成率及增殖活性。结果:(1)感染LV-shPLCε可显著下调前列腺癌细胞LNCAP、PC3中的PLCε、YAP、PSAT1、PSPH、SHMT2及增殖相关基因的mRNA及蛋白质水平,同时抑制细胞的克隆形成能力和增殖活性;(2)在shPLCε组细胞中加入过表达YAP质粒后,能明显逆转YAP、PSAT1、PSPH、SHMT2及增殖相关基因的下调,但加入干扰YAP质粒后结果相反。结论:shPLCε可通过下调YAP的表达抑制前列腺癌细胞的丝氨酸/甘氨酸生成,从而抑制细胞的增殖。