阳春砂3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因的克隆及分析

目的克隆阳春砂萜类生物合成途径上游关键酶——3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase,HMGR)(EC:1.1.1.34)的编码基因;分析基因的功能及其在阳春砂不同组织中的表达。方法用基于RT-PCR的方法从阳春砂叶片中获得编码HMGR的cDNA全长序列,克隆基因编码区;用生物信息学的方法对其编码蛋白进行相似性检索和功能分析;用半定量RT-PCR法比较基因在阳春砂不同组织中的表达差异。结果获得了全长2 023 bp的编码阳春砂HMGR的cDNA序列,命名为AvHMGR(GenBank登记号:FJ455511)。AvHMGR编码的蛋白与其他植物来源的HMGR有很高相似性,含有NADPH结合基序和底物HMG-CoA结合基序,N-端有两个跨膜结构域。保守功能结构域的分析结果表明AvHMGR属于3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶家族。AvHMGR在包括茎、根、果皮和种子团的广泛组织中表达,且在这些组织中的表达量均高于在叶片中的表达。结论从阳春砂中克隆了AvHMGR基因,为进一步鉴定基因功能、探明阳春砂萜类生物合成的基因调控机制打下基础。

阳春砂1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因的克隆及表达分析

【目的】克隆阳春砂萜类生物合成途径的上游关键酶——1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reducto iso merase,DXR)(EC:1.1.1.267)的编码基因;分析基因的功能及其在阳春砂不同组织中的表达。【方法】通过基于逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)的方法从阳春砂叶片中获得编码DXR的cDNA全长序列,克隆基因编码区;用生物信息学的方法对其编码蛋白进行相似性检索和功能分析;用半定量RT-PCR法比较基因在阳春砂不同组织中的表达差异。【结果】获得了全长1749bp的编码阳春砂DXR的cDNA序列,命名为AvDXR1(GenBank登记号:FJ459894)。AvDXR1编码的蛋白与其他植物来源的DXR有很高相似性,含有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)结合基序和DXR活性位点基序,N-端有叶绿体靶向转运肽。保守功能结构域的分析结果表明AvDXR1属于1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸还原酶家族。AvDXR1在包括茎、根、果皮和种子团的广泛组织中表达,且在这些组织中的表达量均高于在叶片中的表达。【结论】AvDXR1基因是阳春砂DXR的编码基因,该基因在阳春砂的叶、茎、根、果皮和种子团中广泛表达。

阳春砂辐射诱变及基于ISSR的变异分析

用组织培养结合辐射诱变的方法进行药用植物阳春砂的育种,对于加快其育种速度、实现高产优质具有重要意义。本研究通过不同浓度的6-BA和NAA配比筛选阳春砂组织培养不定芽的最适培养基,再以组培不定芽为材料,设置不同辐射剂量,进行60Co-γ射线辐射诱变;采用ISSR分子标记技术,对部分诱变材料进行遗传变异分析。结果表明,添加4.0mg/L 6-BA和0.1mg/L NAA的MS培养基不定芽诱导率和出芽倍数最高,分别达到91.4%和2.44;用于阳春砂组培不定芽γ射线辐射的合适剂量为16Gy;ISSR分析结果显示,16Gy辐照获得的2个植株AV16-1和AV16-2在遗传上发生了明显变异,与对照的遗传相似系数分别为0.549和0.563。本研究建立了组织培养结合辐射诱变培育阳春砂新种质的方法,为基于ISSR分子标记技术的诱变育种提供了参考。

柱花草9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶基因(SgNCED1)的克隆及表达分析

9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED）是高等植物ABA生物合成途径中的关键酶，本研究以3种豆科植物NCED的同源序列设计简并引物，用RT—PCR结合RACE以及嵌套PCR的方法。从柱花草叶片中克隆了一个编码NCED的基因，命名为SgNCED1。其cDNA全长2241bp，开放阅读框架为1809bp，编码602个氨基酸。Southern杂交结果表明，该基因在柱花草基因组中以单拷贝形式存在。氨基酸序列同源比对和系统进化分析表明SgNCED1与花生的AhNCED1高度同源（92％），与另外3种豆科植物的NCED也有很高的同源性（72％～75％）。亚细胞定位预测表明SgNCED1蛋白的N-末端具有叶绿体转运肽。叶片脱水诱导的SgNCED1基因的表达与内源ABA的积累、变化同步。

阳春砂不同栽培品种种子的比较研究

【目的】全面认识阳春砂的种子特性,从种子上寻找阳春砂不同栽培品种的差异。【方法】以阳春砂2个主流栽培品种长果、圆果以及选育中品种春选的种子为材料,对种子进行形态、气味和色泽等常规检查,测定千粒质量、含水量、成熟度、饱满度、生活力等参数,进行种子发芽试验,统计不同品种种子的发芽情况。【结果】长果和圆果种子差异较小,而春选与长果、圆果的差异较大。在种子的常规参数方面,春选与长果、圆果比较差异均有显著性意义(P<0.05或P<0.01)。春选种子在发芽试验后期大量萌发,实际发芽率最高,而圆果种子发芽最整齐。【结论】春选种子与长果、圆果种子存在显著差异。本方法为制定阳春砂种子的检验规程和质量标准打下基础。

表达阳春砂HMGR及DXR基因的转基因烟草的构建

【目的】3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase,HMGR)和1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase,DXR)是萜类生物合成途径的上游关键酶,构建表达阳春砂HMGR及DXR基因的转基因烟草,以期在模式植物中分析基因的生物学功能。【方法】采用亚克隆的方法构建AvHMGR和AvDXR的重组植物表达载体,电击转化农杆菌EHA105,获得带有目的基因的工程农杆菌;通过农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草,筛选转基因植株;采用半定量逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)法分析目的基因在转基因烟草中的表达情况。【结果】构建了重组植物表达载体pBI-AvHMGR和pBI-AvDXR及其工程菌;对转基因烟草的PCR检测结果证实AvHMGR和AvDXR已整合到烟草基因组中;目的基因在部分转基因植株中得到表达。【结论】已构建成功表达阳春砂HMGR及DXR基因的转基因烟草。

丁公藤扦插繁殖与组织培养研究

为了建立丁公藤扦插繁殖和组织培养方法,设计正交实验,考察插枝长度、插枝浸润和浇灌的生根液浓度对丁公藤扦插存活及出芽的影响,考察不同种类和浓度的植物激素以及来源于不同叶位的外植体对丁公藤愈伤组织诱导的影响。根据正交试验结果,丁公藤扦插繁殖的最优条件组合为:扦插前浸润生根液浓度为15%、插枝长度为10～12 cm、扦插后浇灌生根液浓度为0.1%,扦插后第43 d的最高存活率和出芽率分别达到87.5%和50%;诱导愈伤组织的最优培养基为MS+0.25 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L6-BA+0.5 mg/L NAA+2 g/L Na2S2O3,室内培养的扦插苗第2位叶为诱导愈伤组织的最适外植体,诱导率最高达94.44%。建立了丁公藤扦插繁殖和愈伤组织诱导方法,为通过人工快繁缓解丁公藤资源紧缺提供了基础。

适合中药材DNA条形码分析的DNA提取方法的研究

目的建立适合中药材DNA条形码分析的DNA提取方法。方法以6种富含次生代谢物质的药用顽拗植物为材料,对7种DNA提取方法进行比较。结果CTAB法3对中药材具有通用性,操作简便、快速,提取的DNA浓度和合格率比其他对照方法高,能满足DNA条形码PCR扩增的要求。该方法主要特点:(1)用3%的CTAB浓度代替常用的2%CTAB;(2)采用1%的PVP与0.2%β-巯基乙醇共同去除杂质和防止DNA降解;(3)采用10000r/min离心15min去除蛋白质等杂质。结论CTAB法3是适合中药材DNA条形码研究的DNA提取方法。

道地产区不同栽培品种阳春砂果实与花形态特征调查与分析

【目的】开展阳春砂高产优质新品种的认定,根据花与果实的形态方面特征为阳春砂的品种认定提供依据。【方法】对阳春砂道地产区(广东省阳春市)的阳春砂品种进行调查,对2个主要栽培品种"长果"、"圆果"和选育中品种"春选"的果实形态性状、花形态性状进行测量和统计。【结果】筛选出不同栽培品种间具有显著性差异的性状。【结论】道地产区阳春砂不同栽培品种在果实和花的形态上具有各自可区别的显著特征。

茉莉酸甲酯调控阳春砂HMGR、DXR和DXS基因表达

【目的】探讨茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate,MeJA)调控阳春砂萜类化合物生物合成途径3个关键酶基因HMGR、DXR、DXS表达的规律。【方法】用20μmol/L和200μmol/L高、低2个浓度的MeJA喷施阳春砂幼苗,诱导不同时间后取样,提取RNA,采用荧光定量PCR法测定AvHMGR、AvDXR、AvDXS相对表达量。【结果】MeJA对AvHMGR、AvDXR和AvDXS的表达均有促进作用,其中对AvDXR的促进作用最明显,AvHMGR次之,两者最高表达量分别达到处理前的9.40和3.95倍;AvDXR基因受高、低浓度MeJA的诱导表达均十分明显,而AvHMGR基因仅对低浓度MeJA敏感,AvDXS基因对高、低浓度的MeJA均不敏感;AvHMGR和AvDXR的表达量在诱导后24 h达到最高峰,在72 h恢复到处理前水平。【结论】诱导子MeJA对AvDXR和AvHMGR基因表达的调控是激发式的,基因表达迅速上调到一定水平,而后逐渐回落。

丁公藤研究概况与展望

丁公藤为旋花科植物丁公藤Erycibe obtusifolia Benth.及光叶丁公藤Erycibe schmidtii Craib的干燥藤茎,是我国的传统中药,含有香豆素类、绿原酸衍生物类、生物碱类等多种化学成分。以丁公藤为主药,目前已开发出多种中成药,如丁公藤药酒、丁公藤滴丸、复方丁公藤胶囊、丁公藤注射液、丁公藤滴眼液等,它们在抗风湿、镇痛、降低眼压等方面均有良好效果。对丁公藤的植物基原、化学成分、药理药效、药品开发与临床应用等进行了综述,展望了丁公藤资源可持续利用研究的前景。

阳春砂ISSR-PCR反应体系的建立和优化

目的建立起适合阳春砂的ISSR-PCR反应体系。方法综合运用单因素实验和L9(34)正交实验两种方法,对DNA模板、引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶等因素进行优化,以及采用温度梯度筛选引物的退火温度。结果最终获得的阳春砂的最优ISSR-PCR体系为:总体积为20μl,其中包括10×ExTaqBuffer(含15mmol·L-1Mg2+)2μl,25ngDNA模板,0.50μmol·L-1引物,0.75mmol·L-1dNTPs和1.0UExTaq酶。通过温度梯度筛选出引物UBC808的最佳退火温度为52.0℃。结论这一优化体系为阳春砂的ISSR分析奠定了基础。

基于26S rDNA D1-D3区和mat K基因序列分析的阳春砂分子鉴别

【目的】建立阳春砂不同栽培品种的DNA分子鉴别方法,为阳春砂的优良品种选育提供依据。【方法】以阳春砂栽培种长果、圆果、"春选"及海南砂为材料,用相应引物对26S rDNA D1-D3区和matK基因进行聚合酶链反应(PCR)扩增和测序,对测序结果进行分析,寻找差异位点,并根据序列构建系统发生树。【结果】测序得到的26S rDNA D1-D3序列为739 bp,阳春砂与海南砂在该区域存在4个碱基位点的差异。长果阳春砂与圆果阳春砂序列相同,但它们与"春选"阳春砂存在1个碱基位点的差异,根据26S rDNAD1-D3序列建立的系统发生树揭示了"春选"阳春砂与另外2个栽培品种间的区别。测序得到的matK序列为824 bp,阳春砂3个栽培品种的matK序列相同,与海南砂存在1个碱基位点差异。【结论】从分子水平上可鉴别阳春砂的3个栽培品种,"春选"品种比长果(或圆果)品种与海南砂有着更近的亲缘关系。

不同发芽条件对阳春砂种子发芽的影响

【目的】比较不同发芽条件及赤霉素引发对阳春砂种子发芽的影响。【方法】以阳春砂种子为材料,比较光照条件、不同发芽床(基质)、不同培养温度对种子萌发的影响;以不同浓度赤霉素(GA3)处理,观察外源激素对阳春砂种子萌发的影响。【结果】(1)阳春砂种子的萌发需要光照。(2)种子在湿润滤纸上的发芽率和发芽势明显优于MS培养基。(3)25℃～30℃培养有利于种子的萌发。(4)400 mg/L的GA3引发有利于促进阳春砂种子的萌发,缩短发芽时间。【结论】适合阳春砂种子萌发的温度范围为25℃～30℃,在湿润滤纸上进行光照培养,并用400 mg/L GA3引发,有利于快速获得大量阳春砂苗。

茉莉酸甲酯影响阳春砂挥发性萜类代谢和基因转录

目的:研究茉莉酸甲酯对阳春砂挥发性萜类合成的影响,深入了解挥发性萜类生物合成的分子调控机制。方法:用不同浓度茉莉酸甲酯溶液喷施阳春砂的叶片和果实,用微波法提取果实中的挥发性萜类成分,应用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术检测挥发性萜类成分的变化,通过转录组测序构建cDNA文库并进行生物信息学分析。结果:果皮和种子团中分别检测到20种和33种挥发性萜类成分,600μmol·L-1MeJA喷果24 h后果皮和种子团中大部分挥发性萜类成分的积累量明显增加,如乙酸龙脑酯、樟脑和龙脑等;而200μmol·L-1 MeJA喷施叶片或果实对果皮及种子团中不同挥发性萜类含量的影响存在差异,且200μmol·L-1 MeJA喷施果实比喷施叶片更能提高种子团中挥发性萜类成分的积累量。此外,转录组测序共获得68 168个Unigene,通过与公共数据库比对,共有48 627个Unigene获得注释。对KEGG代谢通路的注释结果进行初步分析,发现挥发性萜类代谢密切相关的Unigene有208个,MYC2类转录因子(JA信号转导的重要调控因子)相关的Unigene有22个。结论:MeJA能有效调控阳春砂中挥发性萜类成分的代谢,转录组测序获得了多个与挥发性萜类合成相关的候选基因,为深入开展阳春砂挥发性萜类生物合成相关功能基因的发掘及调控研究提供了丰富的数据资源。

基于26S rDNA D1-D3区序列分析的鸡血藤及其混淆品的分子鉴别

【目的】利用26S rDNA D1-D3区序列差异鉴别鸡血藤及其混淆品。【方法】使用改良十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取鸡血藤及其混淆品的总DNA,选择浓度较高的样品作为模板DNA,对26S rDNA D1-D3区进行PCR扩增、测序和序列比对分析。【结果】获得26S rDNA D1-D3区长约700 bp的序列。比对结果显示,不同产地之间鸡血藤的序列一致率为96%和100%,混淆品与正品比较的序列一致率为80%～96%。在26S rDNA D1-D3区384～472 bp的位置有足够的碱基差异位点用以区分鸡血藤及其混淆品。【结论】26S rDNA D1-D3区序列可以应用于鉴别鸡血藤及其混淆品。

阳春砂DXR超表达提高转基因烟草DXR活性及光合色素含量

【目的】筛选阳春砂1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)(AvDXR)转基因烟草T1代植株,鉴定AvDXR基因在模式植物烟草中的功能。【方法】采用抗生素、聚合酶链反应(PCR)法筛选转基因烟草T1代植株;采用半定量逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)法分析目的基因在T1代转基因烟草中的表达情况,采用分光光度法测定酶活性和光合色素含量。【结果】经过抗生素筛选和PCR检测获得AvDXR基因稳定遗传的转基因烟草T1代;AvDXR在部分T1代植株中得到超表达;经测定超表达植株中的DXR活性和光合色素含量均有提高。【结论】AvDXR超表达提高了转基因烟草DXR活性和光合色素含量,获得的AvDXR超表达植株可作为进一步分析萜类成分的材料。

阳春砂HMGR和DXR在烟草中单独及共同过量表达调控萜类化合物的生物合成

目的:HMGR和DXR分别是萜类生物合成途径——MVA和MEP途径的关键酶,本研究探讨阳春砂AvHMGR和AvDXR在转基因烟草中的过量表达对不同萜类化合物生物合成的影响。方法:采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术分析AvHMGR和AvDXR的表达水平,应用专一底物法测定HMGR和DXR的酶活性,利用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术检测不同萜类化合物的变化。结果:AvHMGR或AvDXR单独过量表达抑制了HMGR和DXR的活性,提高了五针松烯、新植二烯、薄荷烯和甾醇的含量;而AvHMGR和AvDXR共同过量表达对不同植株中酶活性的影响有差异,提高了甾醇和植醇的含量,但抑制了新植二烯的积累。结论:AvHMGR和AvDXR单独或共同过量表达对烟草中不同萜类化合物的合成调控存在差异,同时也证明了MVA和MEP途径并不完全独立,而是有着相互交流,本研究为利用阳春砂AvHMGR和AvDXR进行萜类化合物的代谢调控提供了依据。

基于ISSR分析的阳春砂分子鉴别

目的利用ISSR分子标记技术鉴别阳春砂不同栽培品种,并分析其亲缘关系。方法利用ISSR-PCR方法对阳春砂栽培品种长果、圆果和"春选"与海南砂进行基因组多态性分析;采用NTSYS-pcversion2.10e软件计算各供试材料间的遗传相似系数,分析其亲缘关系并构建聚类树状图。结果 10条引物共扩增出114条DNA片段,其中49条DNA片段呈现多态性,占总扩增片段的43.0%。长果阳春砂与圆果阳春砂的遗传相似系数最大,高达1.000;长果、圆果阳春砂与海南砂的遗传相似系数最小,为0.577;各材料间的平均遗传相似系数为0.748。UPGMA聚类分析表明,长果阳春砂和圆果阳春砂聚成一支,再与"春选"阳春砂聚成一支,而海南砂独成一支。结论本研究结果鉴别了"春选"和阳春砂的另外两个栽培品种,证明了"春选"与海南砂有着较近的亲缘关系,建立基于ISSR分析的阳春砂遗传分析方法,为阳春砂的品种鉴别和优良品种选育提供了依据。