大肠杆菌-链霉菌穿梭载体的构建及应用

ＩＪ６０２１和ｐＩＪ４１２３是链霉菌的高拷贝表达载体，它们携带有受硫链丝菌素诱导的强启动子ＰｔｉｐＡ。分别在它们的合适位点插入大肠杆菌质粒的复制子和在大肠杆菌中选择用的抗性标记基因（ｂｌａ），得到了两个能在大肠杆菌和链霉菌中穿梭复制、并保持结构稳定的链霉菌表达载体：ｐＨＺ１２７１和ｐＨＺ１２７２。将透明颤菌（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｉａｓｐ．）血红蛋白基因（ｖｈｂ）克隆到ｐＨＺ１２７２中，用它转化变铅青链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ），经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ分析和ＣＯ结合实验表明，在变铅青链霉菌中表达出了有生物活性的透明颤菌血红蛋白，从而证明所构建的ｐＨＺ１２７２载体具有在链霉菌中表达外源基因的功能。

苏云金芽孢杆菌δ-内毒素cryIA(c)基因在大肠杆菌和变铅青链霉菌中表达

利用合成的寡聚核苷酸片段，从质粒ｐＯＳ１０００中分离出具有适合克隆位点的苏云金芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）δ内毒素ｃｒｙＩＡ（ｃ）全长基因。将该基因与大肠杆菌表达载体ｐＫＫ２２３３重组，并引入大肠杆菌ＪＭ１０９中，经ＩＰＴＧ诱导，获得了超量表达的ＣｒｙＩＡ（ｃ）蛋白。将ｃｒｙＩＡ（ｃ）全长基因插入链霉菌表达载体ｐＨＺ１２７２中，得到重组质粒ｐＨＺ１２５６，将该质粒引入变铅青链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ）ＪＴ４６中，经硫链丝菌素诱导，通过Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ测定表明，重组变铅青链霉菌ＪＴ４６（ｐＨＺ１２５６）已表达出相应的ＣｒｙＩＡ（ｃ）蛋白。杀虫试验表明，大肠杆菌和链霉菌所表达出的δ内毒素ＣｒｙＩＡ（ｃ）对小菜蛾均有毒杀作用，其致死率分别为９３％和５７％。