临床医学“5+3”一体化专业本科阶段基础导师科研带教的实践探究

培养医学人才不能局限于教授理论知识和临床技能,还应注重培养学生的科研思维能力。临床医学“5+3”一体化专业旨在培养具备扎实的医学专业知识和临床技能,同时具有创新意识和能力的高素质临床医师。教育部明确提出科研素质和能力训练要贯穿各个教学阶段。该文从临床医学“5+3”一体化专业学生本科阶段基础导师视角出发,一方面依托早期接触科研训练计划项目,培养临床医学“5+3”一体化专业学生综合运用所学理论知识和技能解决实际问题的能力;另一方面,以项目制开展带教研究,实施教学实践,从发挥导师主观能动性、多举措激发学生科研兴趣、因材施教三个方面总结培养心得与体会。

诱导型巨噬细胞特异性敲除GRK2基因小鼠模型的构建及应用

目的 建立诱导型巨噬细胞特异性敲除G蛋白偶联受体激酶2(GRK2)基因(GRK2^(flox/flox)Lyz2-CreERT^(+))小鼠模型。方法 基于Cre/LoxP系统构建GRK2^(flox/flox)Lyz2-CreERT^(+)小鼠。通过PCR扩增程序及琼脂糖凝胶电泳鉴定GRK2^(flox/flox)Lyz2-CreERT^(+)小鼠的基因型。二氧化碳法处死小鼠后,Western blot检测骨髓源巨噬细胞(BMDMs)和腹腔巨噬细胞(PMs)中GRK2表达。免疫荧光检测小鼠脑、心脏和脾脏巨噬细胞中GRK2表达。流式细胞术分析前列腺素E2(PGE2)诱导的PMs中M1/M2比例。结果 基因型鉴定结果表明,flox扩增产物长度在355 bp处有一条条带且Cre扩增产物长度在355 bp处有一条条带的小鼠即为GRK2^(flox/flox)Lyz2-CreERT^(+)小鼠。Western blot结果显示,与GRK2^(flox/flox)小鼠相比,GRK2^(flox/flox)Lyz2-CreERT^(+)小鼠BMDMs和PMs中GRK2表达降低(P<0.01)。免疫荧光结果显示,与GRK2^(flox/flox)小鼠相比,GRK2^(flox/flox)Lyz2-CreERT^(+)小鼠脑、心脏和脾脏中GRK2表达降低(P<0.01)。流式细胞术结果显示,与GRK2^(flox/flox)小鼠相比,GRK2^(flox/flox)Lyz2-CreERT^(+)小鼠PMs中CD86/CD206比例变化差异无统计学意义。在PGE2(10μmol/L)刺激下,GRK2^(flox/flox)Lyz2-CreERT^(+)小鼠PMs中CD86/CD206比例升高(P<0.01),且GRK2^(flox/flox)小鼠PMs中CD86/CD206比例高于GRK2^(flox/flox)Lyz2-CreERT^(+)小鼠(P<0.01)。结论 该研究成功构建出GRK2^(flox/flox)Lyz2-CreERT^(+)小鼠模型,且该小鼠可促进PGE2诱导的PMs向M2型巨噬细胞极化。

大鼠佐剂性关节炎病程不同阶段T细胞亚群及重要器官的病理学变化

目的 观察大鼠佐剂性关节炎（adjuvant rheumatoid arthritis,AA）病程不同阶段的脾脏T细胞亚群及其重要器官的病理学变化,探讨病程不同的阶段AA大鼠T细胞亚群变化的规律及局部组织和全身重要器官的病理学变化特点。方法 选用20只♂Lewis大鼠,完全弗氏佐剂（CFA）诱导AA模型,造模后d7、d10、d13、d16、d19、d22进行全身评分和关节炎指数评分,计算关节肿胀数。造模后d14（炎症初期）、d22（炎症高峰期）处死大鼠,流式细胞仪检测炎症初期和炎症高峰期脾脏总T细胞（CD3^＋CD4^＋）、记忆T细胞（CD4^＋CD44^＋）、未致敏T细胞（CD4^＋CD62L^＋）的细胞亚群和Th17（CD4^＋IL17^＋）细胞亚群比例。d22取心、肝、脾、肺、肾、踝关节、肠系膜淋巴结组织,光镜观察各组织的病理学改变。结果 大鼠免疫后10d出现继发侧足爪红肿,炎症初期（d10～d14）和炎症高峰期（d19～d22）AA大鼠的全身评分、关节炎指数评分和关节肿胀数有不同程度的增加。踝关节病理见滑膜组织增生、炎细胞浸润,血管翳出现等,且心、肝、脾、肺、肾、肠系膜淋巴结组织的病理也有不同程度的炎性变化。与正常组比较,炎症初期AA大鼠脾脏总T细胞、记忆T细胞和未致敏T细胞亚群比例都无明显变化、炎症高峰期AA大鼠脾脏总T细胞、记忆T细胞和未致敏T细胞亚群比例明显升高;Th17细胞亚群比例在炎症初期和高峰期都明显升高。结论 AA大鼠的T细胞亚群在炎症初期和高峰期出现不同的变化特点;在大鼠AA不仅有关节局部的病理表现,且全身主要脏器组织均有受累。

BAFF-BAFFR及信号转导分子参与佐剂性关节炎的免疫反应及芍药苷-6′-O-苯磺酸酯的作用

目的观察佐剂性关节炎(AA)大鼠炎症不同时期脾脏B淋巴细胞刺激因子(BAFF)及其受体(BAFFR)表达变化以及芍药苷-6′-O-苯磺酸酯(CP-25)对其的影响。方法采用完全弗氏佐剂制备大鼠AA模型,随机分为正常组、AA组、CP-25(25、50、100 mg/kg)组、甲氨蝶呤(0.5 mg/kg)组、白芍总苷(50 mg/kg)组、芍药苷(50 mg/kg)组,造模后第17~31天给药。ELISA法检测外周血BAFF水平;免疫组织化学法、流式细胞术、Q-PCR和Western blot法检测CP-25对脾脏BAFFR表达的影响;Western blot法检测脾脏肿瘤坏死因子相关因子2(TRAF2)蛋白的表达。结果与正常组比较,炎症反应期(D9)、炎症初期(D16)、炎症高峰期(D23)及炎症缓解期(D30)模型大鼠血清BAFF水平和脾脏BAFFR mRNA及蛋白表达均增加。与AA组比较,CP-25(25、50、100 mg/kg)体内给药明显下调AA大鼠脾脏BAFFR mRNA及蛋白表达。体外BAFF刺激后,大鼠脾脏细胞TRAF2及BAFFR蛋白表达显著增加,CP-25(1×10^(-6)mol/L)明显降低TRAF2及BAFFR蛋白的表达。结论 CP-25发挥炎症免疫调节作用可能与其抑制AA大鼠BAFFR受体及TRAF2信号分子表达有关。

HPLC同时测定关节炎大鼠血清色氨酸和犬尿氨酸

建立新的高效液相色谱法(HPLC),检测佐剂性关节炎(AA)大鼠血清中色氨酸(Trp)和犬尿氨酸(Kyn)。SD大鼠成模后取血清,用蛋白沉淀法处理,离心后取上清液进样。考察该方法的专属性、标准曲线、精密度、回收率和稳定性等能否用于AA大鼠Trp和Kyn含量测定。Trp保留时间9.0 min,线性范围25~1 000μmol/L,检测限0.27μmol/L;Kyn保留时间5.6 min,线性范围0.5~10μmol/L,检测限0.07μmol/L;平均回收率在80%~120%范围之内;日内、日间精密度RSD均小于15%,符合生物样品定量分析方法要求,并可应用于AA大鼠血清中Trp和Kyn测定。建立了一种灵敏度高、快速的HPLC分析方法,适于测定AA大鼠血清中Trp和Kyn含量。

新鲜和冷冻人脐带来源间充质干细胞对大鼠骨关节炎的治疗作用比较

目的:比较新鲜和冷冻人脐带来源间充质干细胞对Ⅱ型胶原酶诱导的大鼠骨关节炎的治疗作用。方法:选用Sprague-Dawley (SD)大鼠,采用Ⅱ型胶原酶关节腔注射法建立大鼠骨关节炎模型,将大鼠随机分为正常组(Normal)、模型组(Model)、新鲜人脐带来源间充质干细胞组(Fresh hUC-MSC)、冷冻人脐带来源间充质干细胞组(Frozen hUC-MSC)和透明质酸组(HA),每组10只,于第一次注射Ⅱ型胶原酶后第7天给药。Fresh hUC-MSC和Frozen hUC-MSC组大鼠分别膝关节腔注射Fresh hUC-MSC和Frozen hUC-MSC 1×10^6/50 μL;HA组大鼠给予HA 50 μL;正常组和模型组大鼠给予等体积无菌生理盐水。给药后6周处死大鼠,观察各项指标。检测各组大鼠膝关节周长差值、关节软骨大体观察评分、膝关节X射线观察及评分、膝关节病理变化以及膝关节软骨基质金属蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-13,MMP-13)和基质金属蛋白酶抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)的表达情况。结果:与模型组相比,Fresh hUC-MSC和Frozen hUC-MSC组关节周长差值和关节软骨大体评分均显著减小,差异均有统计学意义(P<0.01);Fresh hUC-MSC和Frozen hUC-MSC组X射线的凯尔格伦-劳伦斯分级评分以及番红固绿染色病理变化的Mankin's评分差异均有统计学意义(P<0.05)。同时,Fresh hUC-MSC和Frozen hUC-MSC组的MMP-13的表达显著降低,TIMP-1的表达显著升高,MMP-13和TIMP-1的比值显著降低,并且差异均具有统计学意义(P<0.01)。结论:Fresh hUC-MSC和Frozen hUC-MSC均能改善大鼠骨关节的损伤,两组治疗骨关节炎差异无统计学意义,为临床应用hUC-MSC治疗提供实验依据。

色氨酸2,3-双加氧酶介导炎症免疫调控的作用和研究进展

色氨酸(Trp)是机体的必需氨基酸之一,主要参与能量代谢、蛋白质合成和产生活性代谢产物,介导多种生理功能。犬尿氨酸代谢通路(KP)是Trp代谢的主要途径,参与机体多个病理生理过程。色氨酸2,3-双加氧酶(TDO2)是KP的初始限速酶之一,能够催化Trp转化为犬尿氨酸(Kyn)和其他代谢产物。越来越多的研究表明,TDO2介导的KP代谢异常参与了肿瘤、神经精神性疾病和炎症免疫相关等疾病的发生发展。TDO2及其催化产生的中间代谢物一方面通过直接作用参与上述疾病的发病过程;另一方面通过调控树突状细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞等免疫细胞介导的免疫反应间接参与疾病。TDO2抑制剂通过调控KP代谢异常,恢复机体免疫系统的正常稳态,如促进肥大细胞瘤小鼠的免疫排斥反应,抑制肿瘤生长;减少肺癌的转移和调控阿尔茨海默病神经炎症等。基于目前的研究基础,进一步探讨TDO2在炎症免疫调控中的分子机制及其介导的KP异常在疾病中的作用,为TDO2成为新的临床治疗靶点提供重要依据。

抑制GRK2异常转膜控制JAK1-STAT1信号转导减少CIA小鼠树突状细胞的成熟

目的G蛋白偶联受体激酶2(G protein-coupled receptor kinase 2,GRK2)异常活化和JAK1-STAT1信号转导异常参与类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)的免疫异常反应,但两者关系不清。该文研究了GRK2对胶原性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)小鼠树突状细胞(dendritic cells,DCs)JAK1-STAT1信号通路的作用和机制,为揭示RA的新机制提供依据。方法建立CIA模型,流式细胞术检测DCs共刺激分子水平,ELISA检测小鼠血浆细胞因子水平,免疫组化法检测脾脏组织中p-JAK1、p-STAT1、GRK2的表达。体外用骨髓细胞诱导成DCs,IFN-α和PGE2刺激48 h。流式细胞术检测DCs共刺激分子水平和吞噬能力,ELISA检测细胞上清中细胞因子水平。CO-IP法检测DCs中GRK2和JAK1共定位。Western blot法检测JAK1、STAT1、胞膜GRK2表达。成像流式细胞术检测p-STAT1入核率。结果CIA小鼠中DCs共刺激分子水平升高,脾脏中GRK2与p-JAK1、p-STAT1的表达呈正相关,且CIA组脾脏中GRK2与JAK1共定位明显下降。体外实验表明,GRK2抑制剂降低DCs共刺激分子表达、IL-6和TNF-α水平,JAK1、STAT1表达、GRK2胞膜表达、p-STAT1入核,增加DCs吞噬功能及GRK2与JAK1的共定位。结论DCs中GRK2转膜异常,介导了DCs的成熟和JAK1-STAT1信号通路活化,抑制GRK2转膜可恢复其对DCs的JAK1-STAT1信号转导的控制,减少DCs的成熟,在改善小鼠CIA中发挥重要作用。

猕猴原代肾小球系膜细胞分离提取培养与鉴定

目的探索一种简单方便、重复性好的非人灵长类动物原代肾小球系膜细胞(GMCs)体外提取、培养及鉴定的方法。方法在无菌条件下取出猕猴肾脏,利用两种不同孔径的纱网(介于100目到200目之间)分离出肾小球,设置不同浓度(0.1、0.2 mg/ml)Ⅵ型胶原酶消化肾小球,同时在这两个浓度基础上设置不同消化时间(10、15 min),将消化后的肾小球接种到细胞瓶中,观察不同消化条件下GMCs的生长状况。显微镜下观察GMCs的结构,免疫荧光和Western blot法检测GMCs中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Nephrin蛋白的表达。利用肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激后观察GMCs生物学特性,CCK-8法和高内涵细胞成像系统法分别检测GMCs活力和增殖情况;Transwell法和细胞划痕实验检测GMCs迁移能力。结果利用0.1 mg/mlⅥ型胶原酶消化10 min搜集到的肾小球贴壁较多,肾小球细胞生长状态较好。原代培养的肾小球3 d贴壁,7 d开始移出不规则形状或星状的细胞,经21~35 d GMCs逐渐铺满瓶底。GMCs中α-SMA蛋白阳性,Nephrin蛋白阴性。10 ng/ml TNF-α体外刺激能显著增强GMCs的增殖与迁移能力。结论利用胶原酶消化法(0.1 mg/mlⅥ型胶原酶消化10 min)成功建立了GMCs的分离及培养的方法体系,为之后更好模拟人类肾脏疾病提供合适的细胞模型。

中药洗剂治疗肛肠疾病280例

目的:探讨中药洗剂治疗肛肠疾病的效果。方法:回顾性分析我院2004～2005年收治的肛肠疾病患者280例,所有患者都采用中药洗剂治疗。结果:280例经中药熏洗2～7d后血栓吸收,疼痛缓解,治愈260例,占92.86%,且治疗时间短暂。结论:中药洗剂治疗肛肠疾病的效果确切,减轻了患者的痛苦,提高了长期卧床患者的生存质量。