基于CRISPR-Cas9系统的HSV-1基因治疗载体的快速构建

基因改造的1型单纯疱疹病毒(HSV-1)载体在肿瘤溶瘤病毒治疗及基因转导中具有广泛的应用前景。本研究报道一种基于CRISPR-Cas9系统的高效快速的重组HSV-1载体构建方法。首先,双顺反表达靶点g DNA和Cas9核酸酶的基因编辑质粒与同源重组模板质粒共转染Vero细胞后,用亲本株感染细胞;然后,Cas9对胞内病毒基因组定点切割,诱导外源基因同源重组,修复至病毒基因组指定位点。通过PCR、Western印迹、免疫荧光等方法证明,相比于传统自发同源重组的构建方法,该方法能显著提升病毒重组率(4.1%vs 1.1%)。同时,本研究建立了一种新的单克隆病毒纯化方案,简化了阳性病毒筛选步骤。本研究结果提供了一种高效快速的重组HSV-1构建方法,这对于HSV-1相关基因治疗及其病理机制研究将具有重要意义。

外伤性视神经损伤后大鼠视网膜中细胞因子的变化和来源

目的利用大鼠视神经夹持损伤模型,观察视网膜中小胶质细胞和星形胶质细胞在不同时间点的激活水平,炎性介质和神经营养因子的时空表达变化情况,探讨这2种胶质细胞在大鼠视神经夹持损伤后在视网膜中可能的免疫调控机制.方法建立SD大鼠视神经夹持模型,分别在建模后1 d、3 d、5d和7 d处死模型大鼠并取材.Western blot检测分析各时间点视网膜IL-1β和TNF-α及iNOS的表达变化情况;免疫荧光组织染色法标记检测各时间点视网膜小胶质细胞和星形胶质细胞的激活情况并检测相应组织中IL-1β、TNF-α、iNOS以及Nestin的表达及分布情况.结果夹持组与对照组相比Western blot法检测发现IL-1β蛋白在损伤后3 d表达量最高,差异与对照组相比有统计学意义(P<0.05),5 d后表达下降,差异与对照组相比无统计学意义(P>0.05).TNF-α在损伤后各时间点表达均升高(P<0.05),损伤后3d表达量达到峰值,与对照组相比差异有显著统计学意义(P<0.01).iNOS水平在损伤后1d显著上升(P<0.05),且表达量最高,在损伤后3 d出现下降,差异与对照组相比无统计学意义(P>0.05).免疫组织荧光化学染色法显示手术组视网膜中小胶质细胞及星形胶质细胞出现了活化.在小胶质细胞中和星形胶质细胞中检测到了IL-1β,iNOS的表达,但在所有时间点都未能观察到星形胶质细胞中TNF-α的表达.在损伤后7d,在星形细胞中观察到了Nestin表达.结论视神经夹持损伤后,视网膜内活化的星形胶质细胞和小胶质细胞是IL-1β、iNOS的主要来源.星形胶质细胞在该模型中随着时间的推移可能展现出神经保护作用.

诱发学生的创新意识

创造是人类进步的源泉，没有创造，人类就不会进步。在现实的生活和实践中许多客观事实都证明了创新能力的重要作用。在竞争激烈的现代社会，主要是科技领域的竞争，科技领域的竞争又主要是人才的竞争，因此，国家更需要创新型人才。