尖孢镰刀菌西瓜专化型RPA检测方法的建立与评价

[目的]构建了西瓜枯萎病菌——尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.niveum,FON)的重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)的快速检测体系,以期为田间西瓜枯萎病的快速检测提供技术支持。[方法]从NCBI网站下载包括西瓜枯萎病菌在内的11种病原真菌的基因组序列,利用SeqHunter 2软件进行生物信息学分析,经比对得到4个FON的特异性基因片段,并对其进行引物设计和筛选。利用聚合酶链式反应(PCR)验证引物的特异性和灵敏度,然后利用建立的RPA检测体系对引物的特异性和灵敏度进行验证,最后进行人工接种FON的西瓜植株的RPA检测与评价。[结果]建立了FON的RPA检测体系,并对DNA恒温快速扩增试剂盒的扩增体系进行最佳反应时间(40 min)和最适反应温度(30℃)的摸索,得到其最佳反应体系的检测下限为100 pg·μL^(-1)。利用DNA恒温快速扩增试剂盒(胶体金试纸条型)进行扩增时,只需在38℃反应12 min,取50μL稀释20倍的扩增产物用胶体金试纸条进行检测,5 min后即可进行结果的判断,检测下限为100 pg·μL^(-1)。[结论]成功构建FON的RPA检测体系,且建立的RPA检测体系能够从温室接种FON之后未显症的西瓜植物组织基因组DNA中检测到FON,可为田间西瓜枯萎病早期的快速检测提供技术支持。

西瓜枯萎病生防菌的分离鉴定及其生防潜力研究

为筛选获得高效防治西瓜枯萎病菌的生防菌株,本研究以胶体几丁质为唯一碳源的培养基,从广东珠海红树林根际土分离的1000余株细菌中筛选到32株具有高几丁质酶活性菌株,采用平板对峙法进行复筛,最终获得10株综合效果好的菌株。温室结果表明,这10株菌株均具有促生及防病效果,其中菌株PL-29处理组相对于对照组防病效果最好,防治效果为63.11%,促生效果同样显著。经形态学、生理生化特征和16S rDNA系统发育分析,最终将菌株PL-29鉴定为黄三素链霉菌Streptomyces flavotricini。此外,抑菌谱试验结果表明,该菌株对辣椒疫霉Phytophthora capsici、灰葡萄孢Botrytis cinerea、立枯丝核菌Rhizoctonia solani等多种病原菌都具有拮抗能力。对菌株PL-29的抑菌作用进一步研究表明,菌株PL-29能抑制尖孢镰刀菌孢子的产生及萌发,从而抑制病原菌的生长。此外,还可以破坏尖孢镰刀菌质膜完整性,诱导ROS积累。综合上述结果表明,黄三素链霉菌S. flavotricini PL-29在防治西瓜枯萎病方面具有较高的潜在应用价值。