成人原代肝细胞的分离、培养及冻存

目的:建立一种稳定的成人原代肝细胞分离、培养、冻存方法,为肝细胞移植、生物人工肝支持系统治疗急慢性肝病以及肝细胞体外应用模型提供潜在的肝细胞资源.方法:20例供肝采用离体两步胶原酶灌注技术分离成人原代肝细胞.选择7个不同的预培养时间点(2、6、12、24、36、48和72h),分离所获肝细胞按上述不同预培养时间在4℃人无血清培养基(HepatoZYME-SFM)中培养,然后收集预培养肝细胞转移到含100mL/L胎牛血清和DMSO的HepatoZYME-SFM中,再立即放入-80℃异丙醇冷冻盒过夜,次日投入液氮.分析比较各肝细胞在解冻后细胞活力率、贴壁率、白蛋白分泌及尿素合成.结果:在部分肝叶切除后使用离体两步胶原酶灌流技术分离所得肝细胞活率和贴壁率分别是75.0%±4.6%和72.0%±6.0%.4℃预培养12或24h被证明是最适预培养时间,这两个时间点的白蛋白分泌高于其他时间点(P<0.05).与立即冷冻组相比较,预培养12或24h肝细胞解冻后活力(61.4%±4.8%,62.0%±5.6%vs53.4%±4.2%)、贴壁率(63.2%±5.8%,62.6%±3.6%vs55.2%±4.6%)、白蛋白分泌及尿素合成水平明显提高(均P<0.05).结论:人肝细胞在冷冻前4℃预培养12-24h可以获得较理想的肝细胞,为药理毒理学、生物人工肝以及细胞治疗的临床应用提供了可能性.

大鼠原位肝移植胆道外引流模型的改进

目的对原有大鼠原位肝移植胆道外引流模型进行改进,建立一个稳定、可靠的大鼠原位肝移植胆道外引流模型,为动态检测移植术后胆汁中各项指标提供可能。方法根据Kamada和王振杰报道的术式加以多项技术改进建立大鼠原位肝移植胆道外引流模型,胆总管内置硬膜外导管外接合适口径的软管,高位空肠造瘘并置入软管,两软管引至右侧腹壁皮下对口相接。结果共施行大鼠原位肝移植98次,24h动物存活率达94.1%,1周动物存活为88.2%。结论此方法简便易行,成功率高,并发症少且可大大提高术后生存率和生存时间,是一种长期、动态收集胆汁的理想模型。

肝移植术后胆道并发症的处理

肝脏移植已经成为治疗各种终末期肝病的有效方法，改善了患者生活质量。然而，肝移植术后胆道并发症仍是移植技术中难以处理的一个问题，严重影响了肝移植患者的生活质量和长期生存率，已经引起全球肝移植界的密切关注。但胆道并发症发生率各中心报道不同，其主要形成原因较为复杂，诊断及处理方法也值得我们展开进一步探讨。一、胆道并发症概况肝移植术后胆道并发症的发生率约为5．8％-24．5％，平均10％左右，并以术后早期多见，严重影响手术的成功率和患者的康复。胆道并发症主要包括胆道狭窄、胆漏、胆道结石、胆泥、管型、胆汁瘤、胆道出血及壶腹部功能障碍等，其中胆道狭窄和胆漏最为常见，约占70％，主要发生在肝移植术后早期，一般与胆道重建技术有关；而晚期的胆道狭窄和梗阻的原因比较复杂，可能与肝动脉闭塞、缺血再灌注损伤、慢性排斥反应等相关。二、胆道并发症形成的原因 1．缺血性损伤：随着供肝短缺的矛盾日益突出，无心跳供者（NHBD）作为一种器官来源受到愈来愈多的关注。与脑死亡供者不同，来自NHBD的供肝均不可避免地经历了一段热缺血损伤，随后在已存在热缺血损伤的供肝将面临继后的冷保存缺血损伤。

BrdU作为脂肪干细胞标记示踪法的可行性

目的:研究BrdU标记猪脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)的最佳剂量及时间,探讨其作为干细胞标记示踪方法的可行性.方法:自中华实验猪背部提取脂肪组织,采用贴壁法分离培养ADSCs,取第3代细胞以终浓度分别为10、15、20、25及30μmol/LBrdU进行标记;另一孔不含BrdU作为对照组,分别培养12、24、48、72及96h.免疫荧光法检测各组细胞BrdU标记率,找出BrdU的最佳标记方法,通过台盼蓝排斥试验、MTT及细胞凋亡检测,观察BrdU对ADSCs生长情况的影响.对第3代的ADSCs采用最佳标记方法后更换普通培养基继续培养,适时传代,连续检测第4、5、6、7、8代ADSCs的BrdU标记率.结果:原代培养的ADSCs的形态主要为长梭形,第3代ADSCs经BrdU标记后胞核呈红色荧光,随浓度的升高及时间的延长,BrdU阳性标记率逐渐升高,以终浓度20μmol/LBrdU标记48h后阳性率达90%以上,且连续传5代标记率仍达40%.MTT、台盼蓝排斥试验及细胞凋亡检测发现BrdU对ADSCs生长增殖基本无影响.结论:BrdU标记ADSCs的最佳剂量和时间为20μmol/L和48h,该方法标记率高,对细胞影响小,可用于动态研究ADSCs在移植体内生长、分化.

HNF4α真核表达载体的构建及其在人脐带间充质干细胞中的表达

目的:构建pcDNA3.1/HNF4α重组质粒,转染人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUMSCs),并检测其在HUMSCs中的表达。方法:采用基因重组技术构建载体pcDNA3.1/HNF4α,经酶切和DNA测序鉴定,通过脂质体法转染HUMSCs后,进行RT-PCR和Western blot分析,免疫荧光检测转染后1周肝特异性生化指标。结果:成功构建真核表达质粒pcDNA3.1/HNF4α,转染人脐带间充质干细胞后,RT-PCR示转染后HNF4αmRNA表达,Western blot分析见HNF4α蛋白表达,免疫荧光示转染1周后HNF4α促进了HUMSCs向肝细胞方向分化。结论:成功构建真核表达载体,并在HUMSCs中正确表达,为进一步研究HNF4α在干细胞向肝细胞分化中作用提供了实验基础。

人脐带间充质干细胞促进肝癌细胞的增殖和转移

目的:研究人脐带来源的间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs)在体内、体外实验中对人肝癌细胞株HepG2的增殖和转移作用。方法:将UC-MSCs在无血清DMEM/F12培养基中培养48 h,收集上清液(MSCsCM)。加入到HepG2的培养基中,使其在HepG2培养基的终浓度为25%、50%和75%作为实验组,DMEM/F12作为对照组,采用CCK-8法检测细胞增殖效应。其后使用Transwell法检测细胞的侵袭效应。建立裸鼠皮下肿瘤模型,健康雌性裸鼠12只随机分为A(HepG2细胞单/左侧皮下成瘤)、B(UC-MSCs+HepG2预混单/左侧皮下成瘤)、C(左侧HepG2、右侧UC-MSCs+HepG2皮下成瘤)3组(n=4),每隔7 d监测成瘤体积变化,50 d后统一处死称量肿瘤湿重。结果:经各浓度MSCs-CM处理后HepG2细胞增殖能力较对照组明显增高(P<0.05);实验组侵袭能力明显高于对照组(P<0.01)。50 d后皮下肿瘤湿重测得A组(0.054 2±0.011 2)g、B组(0.292 0±0.156 9)g、C组[左侧(0.089 4±0.024 2)g、右侧(0.332 6±0.102 9)g],并且从定期体积测量数据发现,两组体积的差异随着时间的推移逐渐增大(P<0.05)。结论:UC-MSCs能促进HepG2的生长和转移,并且这种对肿瘤的增殖和侵袭促进作用可能与UC-MSCs分泌的一些因子有关。

过表达肝细胞核因子4α脐带间充质干细胞促进小鼠大部肝切后肝再生

目的：探讨人源性脐带间充质干细胞（UC-MSC）以及过表达肝细胞核因子4α（HNF4α）的UC-MSC能否促进小鼠大部肝切后肝再生。方法体外分离、培养、鉴定人UC-MSC，慢病毒转染过表达HNF4α。体外收集细胞培养上清液，将L02与上清液共培养，通过细胞增殖实验试剂盒（CCK8）检测细胞增殖活性。体内实验建立肝大部切除模型（约70%），分别经尾静脉向肝切除小鼠移植0.9%生理盐水（NS）、MSC、MSC-HNF4α。48h后比较3组肝切后肝再生的变化，通过免疫组化来观察肝标本Ki67的表达。结果成功分离鉴定UC-MSC，并且成功建立稳定过表达HNF4α的MSC。体外实验MSC组和MSC-HNF4α组中L02的增殖能力都明显高于NS组（P＜0.01），MSC组高于MSC-HNF4α组（P＜0.05）。同样体内实验相对于NS组，经MSC或MSC-HNF4α细胞处理的肝脏，其Ki67的表达明显高于NS组（ P＜0.01），同样MSC组高于MSC-HNF4α组（P＜0.05）。结论 UC-MSC和过表达HNF4α的MSC都分泌一系列因子促进肝再生。

肝细胞移植的进展

肝细胞移植为肝衰竭及代谢性肝病提供了一种全新的治疗策略,是急、慢性肝衰竭患者等待肝源向肝移植过渡过程的有效疗法。它是实施肝脏导向体外基因治疗的工具,作为肝移植的替代疗法,越来越受到重视。现从肝细胞的获取途径、肝细胞移植入体内的方法、肝细胞移植的应用、肝细胞移植的临床进展以及肝细胞移植的不足等方面进行综述。

肝移植治疗慢加急性肝衰竭研究进展

慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure,ACLF)指在慢性肝病的基础上由各种损伤因素引发的急性肝功能失代偿。该病常伴肝外器官衰竭且短期死亡率极高。目前ACLF缺乏有效的治疗手段,肝移植手术是唯一有潜在治愈概率的治疗方式。肝移植的术前评估十分重要。我国由于乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染群体基数较大,需着重考虑HBV相关ACLF的术前情况,并根据COSSH-ACLF、CLIF-ACLF等评分对患者术前情况进行评估。手术时机方面,在患者处于ACLF2级时进行肝移植也许能够提高患者生存获益,但相关结论需要进一步的研究讨论。围手术期主要以病因处理以及多器官衰竭处理为主。术中则需要注意合理安排供体修整和受体游离的时间安排。术后除了肝移植常规并发症外,还需注意感染、肝性脑病、器官衰竭等ACLF相关并发症的处理。术前与术后的器官衰竭情况均与患者长期预后相关。该文结合笔者所在科室大量ACLF肝移植实际工作经验,在查阅大量文献的基础上,就ACLF肝移植术前评估、手术时机选择、围手术期管理、术中注意事项、术后并发症以及长期预后作一综述。

慢加急性肝衰竭的研究进展

慢加急性肝衰竭(ACLF)是在慢性肝脏疾病的基础上发生肝脏急性衰竭和失代偿的临床病症。ACLF的短期病死率较高,主要死因为感染和器官衰竭。引起ACLF的常见急性事件包括细菌或病毒感染、酒精性肝炎以及手术,也有近40%的患者无明显诱因。系统性炎性反应和易感染是ACLF的典型病理生理学特点。ACLF治疗的关键在于识别和处理引起ACLF的急性事件,同时给患者提供多器官支持治疗以应对伴肝病的危重患者复杂的生理指标紊乱。慢性肝功能衰竭联盟(CLIF-C)评分已经用于对ACLF患者的分类和预后评估。肝移植是目前最有可能治愈患者的治疗选择,但是受者的识别、供肝的来源、移植的紧迫性和资源的高效利用都是肝移植广泛应用的壁垒。该文就ACLF的定义、损伤诱因、非手术治疗和肝移植研究进展作一综述。

脂肪供肝对肝癌肝移植预后的作用研究

目的评估脂肪供肝对肝癌肝移植患者肿瘤复发及生存的作用影响。方法回顾性分析2015年1月1日至2018年12月31日在上海交通大学医学院附属仁济医院肝脏外科因肝细胞癌行肝移植治疗的248例患者资料,其中供肝为非脂肪供肝有217例,脂肪供肝为31例。通过收集患者病例资料和肿瘤特点,我们对总体生存率和无复发生存率进行统计分析,评估脂肪供肝对肝癌肝移植患者肿瘤复发及生存的作用影响及危险因素。结果在248例接受肝移植术的肝癌患者中,31例采用了脂肪供肝,脂肪供肝受者与非脂肪供肝受者在年龄、术前甲胎蛋白、性别、乙肝病毒感染、肝硬化、肿瘤个数、肿瘤最大直径、病理分级等方面无显著性差异。脂肪供肝受者与非脂肪供肝受者在1年、3年总体生存率和无复发生存率方面无显著性差异。进一步按照术前是否符合UCSF肝癌肝移植标准进行亚组分类后显示,符合UCSF标准的不同供肝患者总体生存率和无复发生存率无显著性差异。不符合UCSF标准的不同供肝患者的总体生存率无显著差异,但无复发生存率存在显著性差异,且脂肪供肝组的1年、3年无复发生存率较低。结论脂肪供肝受者在1、3年总体生存率和无复发生存率、术后肝功能恢复等方面均与对照组患者无显著性差异,因此轻度脂肪供肝在肝癌肝移植治疗中是安全可行的。同时我们观察到在超出UCSF标准的较大肿瘤、或多发肿瘤患者中,接受脂肪供肝患者的无复发生存率较非脂肪供肝受者低,因此超出UCSF标准的肝细胞癌患者应当尽量避免进行脂肪供肝的肝移植手术。我们期望在对脂肪供肝的脂肪程度进行分级并结合肿瘤分期,患者危险因素等进行更加细致的分层研究后,可进一步扩大供肝范围,合理化供肝分配,使更多的肝癌肝移植患者获益。

干细胞治疗肝衰竭的现状和进展

肝衰竭是多种因素（如病毒感染、毒性药物、代谢疾病、酒精等）引起的严重肝脏损害，导致其合成、解毒、排泄和生物转化等功能发生严重障碍或失代偿，出现以凝血功能障碍、黄疸、肝性脑病、腹水等为主要表现的一组临床症候群［1］。肝移植是目前唯一有效治愈肝衰竭的方法，但由于供肝短缺，费用昂贵，无法满足众多肝衰竭患者的治疗需求，这就要求肝脏病学界探索其他可行的替代治疗手段。干细胞已被证实具有强大的分化潜能、自我更新能力、免疫调节作用以及靶向治疗功能，有望在肝衰竭治疗中发挥重要作用。

肝细胞核因子4α抑制人肝癌细胞株血管内皮生长因子表达和人脐静脉内皮细胞小管形成

背景:肝细胞核因子4α(HNF4α)在肝脏的发育过程中发挥重要作用。研究证实HNF4α与肝细胞癌(HCC)的发生相关。然而HNF4α对人肝癌细胞株血管内皮生长因子(VEGF)表达和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)小管形成的调控作用尚不明确。目的:探讨HNF4α对人肝癌细胞株VEGF表达和HUVEC小管形成的影响。方法:构建过表达HNF4α的慢病毒,并转染人肝癌细胞株HepG 2和SMMC-7721(实验组),以转染慢病毒空载体和未转染的细胞分别作为阴性对照组和空白对照组。分别以qRT-PCR、蛋白质印迹法检测HNF4α、VEGF mRNA和蛋白表达。将HUVEC与HepG2和SMMC-7721细胞不含血清的条件培养基共培养,检测小管形成数量。结果:成功构建了过表达HNF4α的HepG2和SMMC-7721稳转株。与阴性对照组和空白对照组相比,实验组HepG 2和SMMC-7721细胞中VEGF mRNA和蛋白表达均明显降低(P<0.05),HUVEC小管形成数量明显减少(P<0.05)。结论:HNF4α能明显抑制人肝癌细胞株中VEGF表达以及HUVEC小管的形成。

肝细胞核因子4α:肝脏疾病研究与治疗的新方向

肝脏是人体内最大的实质性器官,是人体的“化工厂”.肝脏组织60％～ 80％由肝细胞组成,肝细胞通过特异性地表达一系列功能与分化相关基因,为肝脏发挥重要的生物学功能提供保障.肝细胞核因子4α（HNF4α）是细胞核受体超家族成员,在分化成熟的肝细胞中高表达,能与成熟肝脏中12％的基因的启动子结合,对促进正常的肝细胞分化和维护正常的肝细胞生物学功能发挥着重要的调控作用.近年来,人们开始研究HNF4α与各种肝脏疾病间的关系,并且取得了一定的研究成果,为肝脏疾病的进一步研究和临床治疗提供了新的思路.

比较两组非同期丙型肝炎移植人群:提高抗病毒治疗效力的策略

【据《HPpnfozogy》2012年6月报道】题：比较两组非同期丙型肝炎移植人群：提高抗病毒治疗效力的策略（作者BerenguerM等） 在以往的研究中发现，严重的纤维化与丙型肝炎移植患者抗病毒治疗效果逐渐减弱相关，西班牙ValenciaLaFe医院肝移植和肝病科MarinaBerenguer等进行一项研究，该研究针对性地评估是否调整治疗策略即在纤维化程度较轻时就开始治疗，可以提高效力。

中国肝移植受者肾损伤管理临床实践指南(2023版)

肾损伤是肝移植术后常见并发症,主要包括急性肾损伤和慢性肾脏病。肝移植受者肾损伤严重影响受者长期生存和生活质量,是导致受者术后死亡的主要原因之一。为了规范化和优化肝移植受者肾损伤的诊疗,中华医学会器官移植学分会和中国医师协会器官移植医师分会组织专家在《中国肝移植受者肾损伤管理专家共识(2017版)》的基础上,结合近年来循证医学依据和我国临床实践经验,制订了《中国肝移植受者肾损伤管理临床实践指南(2023版)》,以适应诊疗模式快速发展的新形势。本指南重点阐述肝移植受者肾损伤定义、分类、评估以及术前、术中和术后防治等内容,并科学规范地提出了系列推荐意见,旨在优化我国肝移植受者肾损伤管理。

精准肝脏外科理念在儿童活体肝移植供肝切取术中的临床价值

目的 探讨精准肝脏外科理念在儿童活体肝移植供肝切取术中的临床价值.方法 回顾性分析2012年12月至2014年1月上海交通大学医学院附属仁济医院收治的58例儿童活体肝移植供者的临床资料.术前对供者行CT等检查,将二维影像学数据进行三维重建,评估供者肝内胆管和血管情况,并对肝左动脉和肝左静脉解剖结构进行分型,测算供者标准肝脏体积、拟切取肝脏体积和受者标准肝脏体积,模拟手术操作,制订手术方案.采取精准肝切除切取供肝.采用门诊和电话方式进行随访,随访时间截至2014年4月.结果 58例儿童活体肝移植供者术前CT血管造影检查示肝左动脉Ⅰ型28例、Ⅱ型10例、Ⅲ型20例、无Ⅳ型供者;肝左静脉Ⅰ型35例、Ⅱ型23例.三维重建预测拟切取肝脏体积为（243±65） mL.58例供者均成功完成供肝切取术,其中7例为左半肝切取,51例为肝左外叶切取.2例供者行胆囊切除.术中实际切取肝脏体积为（255±59） mL,拟切取肝脏体积平均误差率为4.94％.移植物质量与受者体质量比为3.3％±1.0％.手术时间为（260±89）min,术中出血量为（181±35）mL,仅1例供者术中输RBC 2 U.供者术后胃肠功能恢复时间为（2.0±1.1）d,术后拔除引流管时间为（3.0±1.2）d,术后住院时间为（7±3）d,出院时所有供者血清WBC、Hb、ALT、AST、TBil、DBil、AIb等指标水平正常.2例供者术后发生并发症,分别为切口少量渗血和脂肪液化,均经对症治疗后痊愈.58例儿童活体肝移植供者术后均获得随访,中位随访时间为8.7个月.供者恢复良好,随访期间无并发症发生.结论 精准肝脏外科理念应用于儿童活体肝移植供肝切取术,切取准确率高、供者肝功能损害小、术后并发症少、恢复快.

肝细胞永生化：实验研究与应用

肝细胞是生物人工肝支持系统的核心原材料，原代肝细胞由于体外生存期短、培养困难而限制了它的应用。目前常用的猪肝细胞有感染内源性逆转录病毒之忧。近年来随着分子生物学的发展肝细胞永生化已成为可能。肝细胞的永生化对于药物毒理、生物人工肝支持系统以及肝脏组织工程的研究都具有非常深远的意义。本文就肝细胞永生化的研究现状及应用前景作一综述。

永生化人肝细胞系的建立及其生物学特性

目的建立一种由慢病毒载体表达人端粒酶反转录酶亚单位,具有原代肝细胞的特性的永生化肝细胞系。方法采用离体两步胶原酶灌注法无菌条件下分离肝细胞,构建慢病毒载体并包装高滴度慢病毒,肝细胞被采用表达永生化基因的慢病毒转染。通过筛选功能基因阳性表达克隆建立永生化肝细胞系,倒置相差显微镜观察形态学变化,免疫组化检测细胞角蛋白18(CK18)表达,RT-PCR及Westernblot检测功能基因及蛋白表达。结果采用功能基因阳性表达筛选建立了永生化肝细胞系,其可连续扩增传代,具有原代肝细胞的特性并未呈现致瘤性,揭示出肝脏实质细胞的形态学特征并且表达肝细胞主要的功能基因标志。结论通过功能基因阳性表达筛选成功建立具有原代肝细胞特性的永生化肝细胞系。

亲水性胆盐对减轻大鼠移植肝肝内胆管冷保存再灌注损伤的作用

目的探讨亲水性胆盐对减轻大鼠移植肝肝内胆管冷保存再灌注损伤的作用。方法应用大鼠原位肝移植胆道外引流模型，将192只SD大鼠随机分为4组，每组供、受者各24只。各组供者在供肝切取前30min经阴茎背静脉注射不同的试剂，对照组注射1ml生理盐水；疏水性胆盐（TDc）组注射牛磺脱氧胆酸钠40μmol／kg；高、低浓度亲水性胆盐（TUDC）组分别注射牛磺熊去氧胆酸钠8（）和40μmol／kg。供肝取出后置于4℃的平衡液中保存2h再植入受者。移植肝再灌注后1、3、7和（或）14d时，采用全自动生化分析仪分别检测受者血清中碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转移酶、胆红素总量、直接胆红素和胆汁中y谷氨酰转移酶和葡萄糖的含量。移植肝再灌注后1d时，在光镜下观察肝内胆管上皮细胞的病理学改变，在荧光显微镜下观察肝内胆管上皮细胞的凋亡情况。结果高、低浓度TUDC组各项观察指标均低于对照组和TDC组（P（0．05），且肝内胆管炎症细胞的浸润、上皮细胞的损伤以及细胞的凋亡等程度均轻于对照组和TDC组（P（0．05）；与低浓度TUDC组比较，高浓度亲水性胆盐组短期内可见各项观察指标均有所降低，但远期各指标的比较，差异无统计学意义（P〉0．05）。TDC组术后各项观察指标均高于对照组（P〈0．05）。结论在供肝获取前，供者静脉注射亲水性胆盐能减轻大鼠移植肝肝内胆管的冷保存再灌注损伤。