传染性法氏囊病毒新型变异株荧光定量RT-PCR检测方法的建立

传染性法氏囊病病毒新型变异株(Novel variant Infectious bursal disease virus,nVarIBDV)给我国养禽业防控法氏囊带来更大的挑战。目前缺乏快速、灵敏的针对nVarIBDV的检测方法。为解决这一问题,该试验根据已发表的nVarIBD的VP2基因序列,设计了一对引物和一条特异性Taq Man探针,建立了一种nVarIBD的Taq Man荧光定量RT-PCR检测方法,该方法可通过特异性扩增nVarIBD VP2基因来确定样品是否为IBDV新型变异株。通过构建重组质粒pMD18-T-VP2对引物和探针进行灵敏性和重复性试验,以及特异性检测,最后使用该检测方法对临床样品进行验证。荧光定量RT-PCR结果显示灵敏性可达1.32×10^(1)copies/μL,高于常规RT-PCR的100倍。批内和批间重复试验变异系数(CV)均小于0.5%,结果表明该检测方法有良好的重复性与稳定性。该方法与常见禽病毒核酸无交叉反应,说明检测方法具有较好的特异性。综合本研究结果表明,该研究建立的nVarIBD荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、灵敏性高、重复性好,可用于临床样品中IBDV新型变异株的监测。

基于消防安全管理的高校化工类实验室管理研究

新形势背景下,为适应现代化教育教学发展所需,高校领导和教师除了完成基本教学任务外,还应强化校园安全管理,特别是针对化工类课程而言,相关管理人员和课程教师需要在消防安全视域下,不断强化实验室安全管理力度,避免火灾、爆炸等现象发生。高校化工类实验室时常发生火灾或爆炸事故,多是因为实验方法不对、实验过程缺失、电气设备故障、危险物品存储不当、泄露易燃气体液体等原因导致。为此,管理人员需要增强消防安全管理力度,避免实验室事故发生,最终保障化工类实验教学能够顺利实施。鉴于此,本文结合实践教学经验,围绕化工类实验室管理展开研究,分析影响化工类实验室安全的具体因素,并在此基础上提出具体的管理对策,旨在促进高校稳定运行,保障师生人身安全。

非洲猪瘟病毒基因Ⅰ型的双重实时荧光定量PCR检测方法建立

随着基因Ⅰ型非洲猪瘟(GenotypeⅠASFV)在我国开始流行,使我国对ASF的诊断、预防和控制更具挑战性。本研究使用中国动物疾病预防控制中心(CADC)推荐使用的B646L引物与探针,结合针对GenotypeⅠASFV EP402R基因保守特异性区域设计引物与探针,建立了一种在诊断ASF的同时可对ASFV进行GenotypeⅠASFV鉴别的快速检测方法,并对其灵敏性、特异性进行检测。结果显示,该方法具有良好的灵敏性以及特异性,可有效用于ASFV的临床诊断以及GenotypeⅠASFV的监测。

一种快速检测非洲猪瘟病毒I177L基因缺失毒株的荧光定量PCR方法

本研究旨在建立一种特异、灵敏、快速的ASFV-G-ΔI177L实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测方法。针对ASFV I117L基因的保守区域设计特异性引物/探针对,通过优化反应条件和反应程序,从而提高检测方法的灵敏性,并验证检测方法的重复性和特异性。对170份临床样品进行了检测,并与OIE推荐的检测方法进行对比。结果表明,基于ASFV I117L基因所设计的特异性引物/探针对,能扩增2.2×10^(1)~2.2×10^(10)copies·μL^(-1)的pMD18-I177L标准质粒,建立的标准曲线R 2可达0.9957,最低检测模板浓度为2.2×10^(1)copies·μL^(-1);该方法扩增反应采用一步法,耗时35 min,批内、批间变异系数均<1.8%;针对ASFV I177L基因特异性扩增,但对其他5种常见猪病毒核酸样品及无酶水未见阳性扩增;用该方法对170份临床样品进行检测,本方法和OIE推荐的检测方法具有良好的一致性。本研究成功建立了一种特异、灵敏、快速ASFV-G-ΔI177L检测方法,为临床非洲猪瘟病毒的监测诊断提供了良好的技术支撑。

猪轮状病毒的分离鉴定和全基因组序列分析

为了解广东省规模化猪场中猪轮状病毒(PoRV)流行毒株的基因特征,本试验在广东省某猪场采集腹泻仔猪肠道组织样品,经实时荧光定量PCR(qPCR)进行病毒初步鉴定;分离获得病毒后,通过间接免疫荧光、电镜观察进一步鉴定,并对分离毒株进行全基因组高通量测序和遗传进化分析。结果显示,qPCR初步鉴定该腹泻仔猪病料为PoRV感染,从阳性病料中分离获得1株能引起典型细胞病变的毒株,在电镜下可观察到似车轮状的病毒颗粒,在倒置荧光显微镜下观察有绿色荧光,将该PoRV分离毒株命名为GD2022,其完整基因型为G9-P[23]-I5-R1-C1-M1-A8-N1-T1-E1-H1;基因遗传进化分析结果显示,GD2022为人轮状病毒、猪轮状病毒和狗轮状病毒基因组重组后的毒株。本试验结果丰富了PoRV基因组学和分子流行病学相关的研究资料,为轮状病毒防控提供了数据支持。

预铺高分子防水卷材用热熔胶的制备及其耐高温和抗紫外性能研究

热熔胶材料已在预铺高分子防水卷材中广泛应用。本研究针对高分子防水卷材的剥离强度、抗紫外性能、低温柔性、抗高温脱落性能等重要性能指标,着重探讨和分析了不同的原材料组分和比例对热熔胶性能的影响。研究结果表明,在热熔胶配方中加入SEBS橡胶和萜烯酚树脂,能够显著提升胶黏剂的抗高温脱落性能;而以氢化石油增粘树脂、硅烷偶联剂等为添加剂,能够有效改善其抗紫外性能。以该热熔胶作为原料所生产出的预铺高分子防水卷材具有优异耐高温和抗紫外性能,可避免夏季高温时混凝土立面卷材的脱落,进而有效保障了建筑防水质量。

应用宏基因组学鉴定国内第一株鸭2型腺病毒

为分离鉴定广东某养鸭场疑似"肝坏死"病例的病原,本研究将采集的病料样品感染番鸭胚及番鸭胚成纤维细胞(MDEF)进行病原分离,提取出现细胞病变培养物的核酸,采用宏基因组学方法,以随机引物反转录并合成双链DNA进行PCR扩增,扩增产物进行分子克隆和测序分析。结果显示:F6代分离的病毒滴度为log10^(5.0)TCID_(50)/m L,能够导致9日龄~11日龄番鸭胚死亡及MDEF产生明显细胞病变。50个随机克隆经Gen Bank检索有28个为鸭2型腺病毒(DAd V-2)同源序列,核苷酸同源性为92%~99%。28个同源序列形成8个毗连序列群,共计15 107 bp,覆盖DAd V-2基因组全长的34.54%,分离株与Gen Bank中唯一的DAd V-2 GR分离株亲缘关系最近,其部分hexon基因编码的氨基酸同源性为83.3%。参照测定序列设计的引物能够特异性扩增病毒基因。本研究首次应用宏基因组学分离获得国内首株DAd V-2,也是迄今除了法国以外国内首次报道的DAd V-2分离株。

NADC34-like PRRSV荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为了建立一种特异性强、灵敏度高、重复性好的NADC34-like PRRSV[我国近年来猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)主要流行株之一]快速检测方法,针对NADC34-like PRRSV的保守基因ORF5设计并合成特异性引物(F/R)和探针(P),筛选最佳引物、探针浓度组合,建立NADC34-like PRRSV实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(reverse transcription PCR,RT-PCR)检测方法,并对该方法进行方法学分析和临床阳性样品检测验证。结果表明:该方法反应体系中,引物(F/R)和探针(P)的最佳工作浓度分别为0.4μmol/L和0.2μmol/L;该方法荧光定量RT-PCR曲线在1.56×10^(1)~1.56×10^(10)拷贝/μL范围内呈现良好线性关系,灵敏度可达1.56×10^(1)拷贝/μL[高于常规RT-PCR(1.56×10^(3)拷贝/μL)],批内和批间重复实验变异系数均小于0.50%;采用新建立的荧光定量RT-PCR方法检测132份NADC34-like PRRSV阳性样品,均获得荧光信号曲线。实验结果说明:所建立的NADC34-like PRRSV荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于临床样品NADC34-like PRRSV检测。

副猪嗜血杆菌培养条件优化

三三三三三三三三三三三三[摘要]本试验对副猪嗜血杆菌的基础培养基成分、血清浓度、培养基pH值、保存条件进行优化筛选,旨在得出副猪嗜血杆菌的适宜培养保存条件,为副猪嗜血杆菌的发酵生产提供可靠的依据。通过试验得出,副猪嗜血杆菌的最佳培养保存条件:培养基起始pH值为7.3～7.5,成分为胰蛋白胨1.5%、大豆蛋白胨0.5%、NaCl0.5%、酸水解酪蛋白0.5%、葡萄糖0.2%、5%新生牛血清和NAD0.01%,用10%脱脂奶粉冻干保存在-20℃。

禽腺病毒血清4型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

根据禽腺病毒血清4型(FAdV-4)的Hexon基因设计1对特异性引物和探针,经反应条件优化,建立了荧光定量PCR检测方法。结果显示:以重组质粒为标准品建立的标准曲线在7.3×10^3拷贝/μL^7.3×10^8拷贝/μL具有良好的线性关系;该方法仅对FAdV-4扩增呈阳性,对NDV、AIV、IBV、IBDV、ILTV、FPV、FAdV-8a、FAdV-8b的检测均为阴性;对FAdV-4最小检出的梯度为7.3×10^1拷贝/μL,灵敏度为普通PCR的100倍;批内和批间重复试验的变异系数均小于2%。对50份临床样品进行检测,表明该方法的检出率比普通PCR方法高10%,可用于FAdV-4的快速诊断和定量分析。