重组枯草芽孢杆菌全细胞催化生成L-酪氨酸

目的:本研究构建一株重组枯草芽孢杆菌工程菌,实现以苯酚、丙酮酸和氨为底物全细胞生成L-酪氨酸(L-tyrosine,L-Tyr),并优化其细胞培养条件和催化反应条件,以期提高L-Tyr的产量。方法:将来源于Pantoea agglomerans的酪氨酸酚裂解酶(Tyrosine Phenol-Lyase,TPL)经密码子优化后在枯草芽孢杆菌中异源表达,通过单因素实验优化了重组菌诱导表达条件和全细胞转化条件,旨在提高L-Tyr产量。结果:重组枯草芽孢杆菌在20℃,2.0 g/L木糖诱导培养36 h时TPL活性最高达到4.65±0.15 U·g^(−1),在75 mmol/L苯酚、75 mmol/L丙酮酸钠、487 mmol/L氯化铵、2.0 g/L亚硫酸钠、2.0 g/L EDTA、0.08 g/L磷酸吡哆醛(Pyridoxal Phosphat,PLP)、湿菌体50 g/L、pH=8.0、35℃的全细胞转化条件下,L-Tyr达到9.38 g/L,转化率为73.24%。为了进一步改善高浓度苯酚导致TPL酶活力下降问题,在全细胞转化环节采用分批补料方式,20 h后得到15.12 g/L L-Tyr,转化率为75.51%。结论:研究结果表明重组枯草芽孢杆菌可以成功转化苯酚、丙酮酸钠合成L-酪氨酸,为全细胞生物制备食品级L-酪氨酸提供了理论和技术基础,具有良好的应用前景。

乳酸乳球菌谷氨酸脱羧酶B重组质粒的构建、异源表达及酶学性质的研究

目的:旨在研究乳酸菌谷氨酸脱羧酶B(Decarboxylation of glutamic acid,gadB)的异源表达及其酶学性质。方法:以Lactocus lactis subsp.lactis Il1403的gadB基因序列为目的基因,实现gadB在大肠杆菌中的异源表达,探究其酶学性质,实现高效催化合成γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid,GABA)。结果:重组菌经IPTG诱导gadB过量表达后,进一步采用Ni^(2+)亲和层析纯化gadB,经SDS-PAGE分析,在54 ku处出现明显条带,经检测可溶性蛋白含量约占70%。对酶学性质进行研究,gadB的最适pH值为4.8,最适反应温度为40℃,Na^(+)和Mn^(2+)限制gadB的酶活力,而Mg^(2+)和Zn^(2+)明显刺激酶活。对酶底物浓度进行研究,谷氨酸脱羧酶B的K_(m)为123.83 mmol,V_(max)为0.79 mmol/min。结论:该研究探索了gadB的酶学性质,为基因工程菌工业化生产γ-氨基丁酸提供了实验基础。