K55R与ep8叠加突变对扩展青霉脂肪酶热稳定性的改善

利用重叠延伸PCR对扩展青霉脂肪酶(PEL)基因进行体外定点突变,构建了K55R与随机突变体ep8叠加突变的重组质粒pAO815-ep8-K55R。将该质粒电转化引入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,进行异源表达。实验结果表明:该叠加突变体在毕赤酵母中获得了活性表达,得到表达产物脂肪酶PEL-ep8-K55R-GS。其表达量为508u/mL,分别约为野生型脂肪酶PEL-GS(627u/mL)的81%,随机突变脂肪酶PEL-ep8-GS(924u/mL)的55%;其比活力为2309.1u/mg,与随机突变脂肪酶PEL-ep8-GS和野生型脂肪酶PEL-GS的相仿。叠加突变脂肪酶PEL-ep8-K55R-GS的最适作用温度为37℃,与野生型脂肪酶PEL-GS和随机突变脂肪酶PEL-ep8-GS一致;其Tm值为41.0℃,比野生型脂肪酶PEL-GS提高了2.3℃,比随机突变脂肪酶PEL-ep8-GS提高了0.8℃。表明叠加突变脂肪酶PEL-ep8-K55R-GS的热稳定性有了进一步的提高。

基于非靶向代谢组学的冠突散囊菌发酵代谢产物分析

冠突散囊菌在降糖降脂功能性食品和天然药物的开发中具有重要的应用价值。分析冠突散囊菌整体代谢产物信息和产生的降糖降脂活性成分,可以为菌株的开发和应用提供理论基础和数据支持。以冠突散囊菌菌株Ys-Ec-01为试验材料,采用基于超高效液相色谱-四级杆静电场轨道阱质谱(UHPLC-QE-MS)技术的非靶向代谢组学,结合主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)方法,分析Ys-Ec-01发酵代谢产物谱,寻找降糖降脂活性产物。结果表明:Ys-Ec-01发酵后代谢产物谱发生显著变化。从代谢产物谱中,鉴定出365种发酵产物,进而筛选出205种差异发酵产物和151种主要发酵产物,鉴定到13种降糖降脂活性成分,分别是金圣草黄素、山奈酚、异鼠李素、表儿茶素、辣椒素酯、烟酸、葫芦巴碱、1-脱氧野尻霉素、尿囊素、原儿茶酸、亚油酸、胆碱和L肉碱。这些活性成分为Ys-Ec-01的降糖降脂功能研究和开发应用提供更多靶点和基本信息。

1+X 证书制度下药学类专业“三教”改革的思考与探索

1 X证书制度是在现代职业教育改革背景下创设的一种新型人才培养模式,其对提升学生岗位技能、增强学生社会竞争力、促进教师教学改革等方面都具有积极意义。与其他专业相比较,药学类专业具有较高的实践性和技能性。在实施开展1 X证书制度,药学类专业存在学生专业岗位能力不足、学校课程设置不合理、教学师资实践性偏差等现实问题。如何充分依托1 X证书制度改革发展契机,以“三教”改革为着力点,从培养“三师一体”教师、开发“课证融合”教材、实施“多边教学”改革开展实施对策,达到培养药学类复合型技术技能人才的发展目标。

纤维素内切酶的异源表达及分子改造研究进展

纤维素内切酶在应用中存在产量较低、热稳定性差和活性偏低等问题。纤维素内切酶产生菌的选育,异源表达和分子改造是解决这些问题的有效途径。产生菌的选育包括传统的选育和基于组学技术的筛选,后者更有效率。异源表达系统主要为大肠杆菌和毕赤酵母,而后者具有更多的优势。提高热稳定性和活性是分子改造的主要目标。改造酶的结构,可以提高热稳定性,而活性通常也能随之提高。理性化设计比传统分子改造技术具有更高的效率,是分子改造发展的主流技术。

基于中医“治未病”思想建设糖尿病健康教育与管理示范基地

从糖尿病流行和当前防控策略、发展趋势及瓶颈出发,介绍通过建设糖尿病健康教育平台、糖尿病健康管理平台、糖尿病防控科研平台打造国家级“健康教育—健康管理—中医调养—技术研究”四位一体糖尿病防控示范基地,以中医“治未病”思想及防治技术为核心,凸显多学科“治未病”教育与康养、个体化自我管理教育、技术研发与专业人才培养并行的特色。

拟企业化生产实训在药品生物检定技术实践教学中的应用

《药品生物检定技术》是生物制药技术专业的一门专业课,与其他课程一同培养高职生物制药技术专业学生的职业能力及职业素养。在传统的单一模块化的实验操作教学中,学生实验独立性差,难以达到课程培养目标,为了解决该问题,该课程与其他课程共同完成了拟企业化的生产实训项目。项目建设包括:教师自身素质的提高;开发基于企业产品生产过程的实训教材;建设开放式实训基地;拟企业化的生产组织和管理方式;分级考核制度的过程性考核评价体系。经过5年13批次的实训,取得了良好的效果。

苦瓜复方胶囊对糖尿病小鼠血糖的干预作用

目的观察苦瓜复方胶囊对四氧嘧啶诱导的糖尿病模型小鼠血糖水平的影响。方法将正常小鼠随机分为对照组、苦瓜复方胶囊A高剂量组和苦瓜复方胶囊B高剂量组,每组15只,分别比较空腹血糖水平;将四氧嘧造模成功小鼠随机分为模型组、胶囊A高、中、低剂量组(1.2,0.4,0.2 g·kg^(-1))和胶囊B高、中、低剂量组(1.2,0.4,0.2 g·kg^(-1)),每组13只;给药方案为1日2次,连续30 d,必要时延长至45 d;进行糖耐量试验,并在给药后15 d、30 d、45 d测定空腹血糖,比较各组的血糖水平。结果苦瓜复方胶囊A和B对正常小鼠空腹血糖水平均无影响;给药30 d后,胶囊A高、中、低剂量组和胶囊B中、低剂量组的空腹血糖值与模型组比较有显著性降低(P<0.05);胶囊B高剂量组无显著性差异,当给药延长至45 d,空腹血糖值与30 d相比无显著性差异(P>0.05);在糖耐量试验中,胶囊A高、中、低剂量组与模型组比较,其血糖曲线下面积显著减少(P<0.01);胶囊B中、低剂量组与模型组比较,其血糖曲线下面积亦显著减少(P<0.05)。结论苦瓜复方胶囊A和B对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠模型均有一定的降糖作用;胶囊A的降糖效果优于胶囊B,但需进一步毒性试验比较两者的毒性大小。

高职生物制药技术专业《基因工程技术》实践教学改革

《基因工程技术》是高职高专生物制药技术专业中一门重要的专业课程,针对传统的《基因工程技术》教学体系存在理实比例不合理、内容相互割裂、缺乏贴近行业的创新性实训项目等的问题,从生物制药技术专业的《基因工程技术》理实一体化的教学改革入手,改变教学模式,设计符合企业实际的生产性实训项目及配套教材、考核评价方式,并比较改革前后的教学效果,肯定了理实一体化教学及综合生产性实训的教学效果。

纤维素酶分子改造技术研究进展

纤维素酶是一组可将木质纤维素降解为葡萄糖的复合酶,已广泛应用于生物转化、食品、纺织、造纸、饲料和洗涤剂等多个行业中。纤维素酶分子改造的研究对于解决当前全球的多种重大问题如能源危机、环境污染、饲料资源紧张、粮食短缺等具有重要的现实意义。该文综述了纤维素酶分子改造的多种技术,如定点突变技术、易错PCR、DNA改组等。

金针菇菌渣的发酵工艺研究

以金针菇菌渣为研究对象,添加一定比例的高温纤维菌、酵母菌、马粪以及硫酸铵,通过对比试验和四因素三水平正交试验确定了金针菇菌渣发酵中多种菌剂和添加辅助剂的最佳配比。试验结果表明,金针菇菌渣发酵最佳工艺条件为:高温纤维菌40 m L/kg,酵母菌20 m L/kg,马粪80 mg/kg,硫酸铵50mg/kg。通过优化菌渣发酵工艺,建立简便高效地处理方法,实现菌渣快速转化为有机肥,并达到国家标准,为制成的有机肥直接用于农业生产提供参数依据。

高职药学专业学生“1+X”考证意愿与评价性调查

目的对目前高职药学专业“1+X”考证存在的各种客观问题开展分析,并提出一些探索性的改革思路。方法利用问卷星软件对107名应届药学毕业生开展问卷调查。问卷项目内容包括参加“1+X”考证项目数量、项目名称、考证时间投入、证书类型与意愿期望、考证动机及原因、总体实用性评价等。结果通过调查发现,目前高职药学专业学生“1+X”考证项目中存在证书可选性过窄、适用性不强、技能性偏弱等问题。结论改革现有职业岗位证书的制度弊端、强化证书与岗位实践技能的有效融合、探索课证融合的职业教育新路径等措施将有助于实现高职药学专业“1+X”考证更高质量的发展。

基于产教融合的高职微生物学教学改革探究

微生物学是高职生物制药技术专业中重要的专业基础课程。针对传统微生物学实践教学存在基础训练不到位、实验内容脱节等问题,改革教学模式,设计符合岗位需求的实训项目及配套教材、考核评价方式,并比较改革前后的教学效果,肯定了基于产教融合的高职微生物学教学改革效果。

在GMP教学中引入拟企业化生产实训的探讨与实践

在GMP教学工作中，如何能够使学生很好地理解枯燥的法规条文是一直困扰我们的问题，作为载体的拟企业化生产实训的引入，能使学生形象地理解、掌握GMP的相关内容，并对企业生产方式有了感性认识，对学生走上工作岗位，实现身份的“无缝”转换，具有良好的效果。

高通量脂肪酶稳定性测定法-ANS法的建立

根据蛋白质变性后结构变化的特点和荧光探针8-苯胺基-1-萘磺酸（8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid,ANS）的特性,建立了一种快捷而准确的脂肪酶热稳定性（Tm）测定的新方法——ANS脂肪酶稳定性测定法,即将脂肪酶在25℃-65℃的不同温度下保温30 min后,加入到ANS反应体系（0.2 mg/mL酶蛋白,0.05 mmol/L ANS,20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.2）,100-500 mmol/L NaCl）中。在激发波长378 nm,发射波长465 nm下测定荧光值。通过GraphPad Prism软件分析得出脂肪酶的Tm。利用该方法测定了野生型扩展青霉脂肪酶及其突变体的Tm值,结果与传统的NaOH滴定和平板透明圈法的测定结果相似。同时,利用该方法可在96孔板上快速完成数十个样品的Tm测定,从而成为一种快速、可靠、可用于高通量的酶稳定性的测定方法。

毕赤酵母高密度发酵工艺的研究

高密度发酵是毕赤酵母提高蛋白表达量的一种重要策略,发酵工艺是高密度发酵的一个重要因素。采用下列措施均可以有效地提高表达水平:调节基础培养基,采用变pH和变温发酵,提高DO,选择最适的诱导前菌体密度和比生长速率并降低甘油初始浓度和采用分段式指数流加进行调控。选择合适的甲醇补料策略:甲醇限制补料(MLFB)、氧气限制补料(OLFB)、甲醇不限制补料(MNLFB)和温度限制补料(TLFB)。采用两种方式调控补料:诱导阶段菌体生长时,甲醇比消耗速率(qMeOH)为0.02-0.03gg-1h-1,而菌体不生长时,qMeOH采用较高值。

高职生物制药技术拟企业化生产实训模式的构建

因行业特殊性,高职生物制药技术专业学生的生产实训很难在生产企业进行,为此尝试构建校内模拟生产的拟企业化生产实训模式,实现实训与生产的基本一致,有效提高学生的职业技能和职业素养,取得了显著的成效。该模式主要包括:组建具有生产管理和教学经验的教学团队;开发基于抗生素生产过程的"多粘菌素E生产实训"项目并编写相应的生产实训教材;组建高度仿真兼具科研和社会服务功能的开放式实训基地;构建企业化的生产组织和管理方式;创建分级考核制度的过程性考核评价体系。

丁醇产生菌育种研究进展

生物丁醇产业因发酵法的产量、产率和比例低等原因受到限制。菌种改良是解决问题的一个重要和根本的策略。诱变育种仍然是工业育种的主要方法,复合诱变和理性化筛选更有效。基因工程育种对丙酮丁醇梭菌和大肠杆菌丁醇合成途径进行改造和构建优化,还可改造途径外影响合成的其它基因,以获得高产菌株,发展最为迅猛,但效果仍低于诱变育种。今后的菌种改良方向仍为提高产量和比例。

东方肉座菌EU7-22纤维素内切酶Ⅰ的异源表达

[目的]实现东方肉座菌纤维素内切酶EGⅠ在毕赤酵母中的表达,获得重组EGⅠ。[方法]通过RT-PCR获得EGⅠ开放阅读框。将EGⅠ成熟肽和PHO1信号肽的DNA片段插入p PIC3. 5K后,重组表达载体电转化毕赤酵母。通过甲醇诱导表达和镍柱纯化获得EGⅠ。以羟甲基纤维素钠检测活性,以肽N-糖苷酶F分析N-糖基化,以SDSPAGE分析表达情况和糖基化修饰。[结果]获得EGⅠ分泌表达菌株,诱导96 h后上清液活性为0. 513±0. 002 U/m L,纯化后的EGⅠ活性为0. 558±0. 012 U/mg。SDS-PAGE表明EGⅠ分子量在100～180 k Da,远高于预测值47. 3k Da,经肽N-糖苷酶F处理后,降至63～75 k Da。[结论]实现了EGⅠ的分泌表达,获得活性为0. 558±0. 012 U/mg的糖基化重组EGⅠ。

小菜蛾Toll-6基因的克隆及功能分析

为探究Toll-6基因在小菜蛾Plutella xylostella先天免疫中的功能,对克隆鉴定的Toll-6基因序列进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR检测Toll-6基因的时空表达模式及微生物侵染响应模式,体外验证其在微生物结合、病原相关分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP)结合和细菌凝集等方面的功能。结果表明:Toll-6基因全长2 313 bp,编码770个氨基酸,预测Toll-6蛋白具有富含亮氨酸重复序列(leucine-rich repeats,LRR)胞外区、跨膜区和Toll/白介素-1受体同源(Toll/interleukin-1 receptor homologous,TIR)胞内等典型Toll受体家族特征;Toll-6基因在不同发育阶段及不同组织中均有表达,其中成虫期表达量最高,4龄幼虫期次之,在4龄幼虫中肠表达量最高;此外,苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis菌株Bt8010侵染小菜蛾4龄幼虫6 h后,Toll-6基因表达被显著抑制,而黏质沙雷氏菌Serratia marcescens菌株SmPXG6侵染小菜蛾4龄幼虫12 h时,Toll-6基因表达被显著上调,18 h后Toll-6基因表达被显著抑制;蛋白体外功能验证表明Toll-6蛋白不仅与细菌和真菌有直接结合能力,还能与肽聚糖和脂多糖结合,但不具备细菌凝集功能。表明Toll-6蛋白可能作为模式识别受体直接识别并结合入侵病原微生物表面的PAMP,启动小菜蛾对入侵病原微生物的先天免疫防御,且对不同微生物可能具有不同的响应机制。