瓜实蝇雄性决定因子基因MoY功能及其上游调控序列活性分析

【目的】本研究旨在鉴定瓜实蝇Zeugodacus cucurbitae雄性决定因子基因MoY上游调控序列,并探索该序列在胚胎早期驱动MoY表达对瓜实蝇性别决定的影响,为后续的瓜实蝇转基因品系的构建提供参考依据以及可用元件。【方法】使用基因组步移法扩增瓜实蝇Y染色体连锁的MoY上游序列并测序,将获得的上游序列连接MoY的CDS区构建其驱动MoY表达的质粒;将MoY表达质粒注射进瓜实蝇新鲜的胚胎中,待胚胎孵化后观察成虫的表型以及性比并提取基因组DNA,通过使用基因组DNA扩增MoY以判断获得的MoY上游调控序列是否具有驱动MoY表达的功能,同时分析MoY在胚胎中的表达对性别决定的影响。【结果】克隆并获得瓜实蝇MoY上游1660 bp序列,构建该序列驱动MoY表达的质粒p1660。由注射胚胎发育而来的瓜实蝇雄成虫18头和雌成虫13头及另外发现3头成虫的生殖器发育异常且MoY的扩增结果为阴性,确认为间性个体。【结论】本研究通过对MoY进行基因组步移扩增发现所获得的瓜实蝇MoY上游调控序列具有驱动MoY表达的活性,当MoY于瓜实蝇胚胎早期表达可使原本发育为雌性的个体出现性别逆转的现象。

黄翅绢丝野螟求偶及交配的行为节律

【目的】探明黄翅绢丝野螟Glyphodes caesalis的求偶及交配行为节律,为该虫性信息素提取鉴定、两性通讯机制和群集诱杀技术研究提供理论基础。【方法】统计黄翅绢丝野螟的雌、雄蛹性比,测定成虫在光期和暗期的羽化率,观察其求偶和交配行为;利用等比配对试验测定寄主(菠萝蜜)、成虫日龄和暗期时段对交配率、交配时长和交配次数的影响。【结果】黄翅绢丝野螟雌、雄蛹平均性比为1.06∶1,雌蛹占比显著大于雄蛹占比。黄翅绢丝野螟成虫羽化高峰期集中于光暗转换期的前、后2 h,交配仅发生于暗期,寄主(菠萝蜜)的存在对该虫交配有促进作用,有果组交配率为93.33%±2.89%,显著高于无果组(71.67%±14.43%);有果组和无果组交配日龄分别为3-5日龄和3-7日龄;有果组3日龄成虫的交配率为53.33%±11.55%,显著高于无果组(31.67%±5.77%),两组交配率随日龄增加逐渐降低。有果组交配时段主要集中在进入暗期的0-2 h,其中暗期0-0.5 h为交配高峰期,较无果组提前,交配率为36.67%±17.56%;无果组交配时段主要集中在暗期的0-3.5 h,其中暗期1.0-1.5 h为交配高峰期,交配率为16.67%±11.55%。黄翅绢丝野螟雌成虫最多交配2次,雄成虫最多交配4次,但雌、雄成虫的交配比例随交配次数增加而递减;首次交配时间越早其多次交配概率越高,首次交配发生于3日龄的雌、雄成虫分别可进行2次和4次交配,首次交配发生于5日龄后的雌、雄成虫均无多次交配行为。【结论】黄翅绢丝野螟可进行多次交配,寄主菠萝蜜对其交配有促进作用,该虫交配行为具节律性,仅在暗期发生交配,交配高峰期为3-4日龄、大多发生在暗期的0-2 h内。

腰果角盲蝽气味结合蛋白基因HtheOBP3的克隆及组织表达分析

为明确腰果角盲蝽Helopeltis theivora气味结合蛋白3(odorant binding protein 3,OBP3)功能及其嗅觉感受机制,利用PCR技术结合c DNA末端快速扩增(rapid amplification of c DNA ends,RACE)技术克隆其cDNA全长序列,利用多个生物信息学软件对其进行序列分析,并通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)技术检测其在腰果角盲蝽成虫不同组织中的表达量。结果显示,腰果角盲蝽HtheOBP3基因(GenBank登录号为QHI06949)开放阅读框为474 bp,编码157个氨基酸残基,预测蛋白分子量约为17.15 kD,等电点为5.14,无信号肽和跨膜结构,蛋白氨基酸序列中具有6个保守半胱氨酸残基和性信息素结合蛋白-普通气味结合蛋白(pheromone binding protein-general odorant binding protein,PBP-GOBP)家族的保守结构域。HtheOBP3蛋白具有6个α-螺旋和3对二硫键,其中5个α-螺旋形成1个结合口袋。腰果角盲蝽HtheOBP3与其他20种半翅目昆虫OBP的6个保守半胱氨酸位点完全一致,腰果角盲蝽HtheOBP3的氨基酸序列与薇甘菊颈盲蝽Pachypeltis micranthus PmicOBP4的氨基酸序列一致性最高,为55.56%。在37种不同昆虫的OBP蛋白中,腰果角盲蝽HtheOBP3与6种半翅目昆虫OBP聚为一个分支,其中与薇甘菊颈盲蝽PmicOBP4亲缘关系最近。腰果角盲蝽成虫各组织中HtheOBP3均有表达,其中在触角中表达量最高,其次为足。表明腰果角盲蝽HtheOBP3是典型的气味结合蛋白,其可能兼具嗅觉和非嗅觉感受等生理功能。

黑腹果蝇ord基因的原核表达及生物信息学分析

黏连蛋白ORD(orientation disruptor)是维持黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)减数分裂姐妹染色单体间黏连与卵母细胞同源重组、联会所必需的。本研究旨在对黑腹果蝇ord基因进行原核表达,并对其表达蛋白进行生物信息学分析。通过PCR扩增出黑腹果蝇ord基因,采用同源重组法构建pET-sumo-ORD重组质粒,经IPTG诱导表达,对表达蛋白进行SDS-PAGE及Western blotting验证。结果表明,诱导表达的His-ORD融合蛋白大小约为69 kD,为包涵体蛋白。系统发育树分析表明,黑腹果蝇与毛里求斯果蝇(Drosophila mauritiana)、塞舌尔果蝇(Drosophila sechellia)和拟果蝇(Drosophila simulans)的ord基因亲缘关系较近。生物信息学分析表明,ORD蛋白的预测等电点(pI)为5.69,疏水性平均值(GRAVY)为-0.309,属于亲水性蛋白质,其二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。蛋白互作网络分析表明,ORD与INCENP存在相互作用,与CONA、CG13541共同定位。本研究结果为深入研究该基因的功能以及促进减数分裂黏连体研究提供了理论依据和试验基础。