糜子SAMS基因的克隆及其在干旱复水中的表达模式分析

以糜子抗旱节水研究中获得的一个与S-腺苷甲硫氨酸合成酶（SAMS）基因同源性较高的EST序列为基础,采用RT-PCR技术从糜子中分离到一个SAMS基因的全长cDNA序列（命名为PmSAMS）,全长1293bp,编码396个氨基酸,具有SAMS典型的N端结构域、中间结构域及C端结构域。糜子、马铃薯、拟南芥、甜菜、大麦、荔枝、番茄和水稻8种植物SAMS的氨基酸序列多重比较分析表明,不同植物的SAMS的氨基酸相似程度非常高（92%~97%）,其中糜子与水稻的相似性最高（97%）,说明SAMS基因在植物进化中非常保守。PmSAMS基因在糜子幼苗干旱及复水过程中的半定量RT-PCR表达模式分析表明,在干旱早期（土壤含水量36%）诱导该基因大量表达,而干旱程度更严重时（土壤含水量为24%）其表达受到严重抑制,表达量比对照还低;严重干旱后复水2h,其表达量增强至干旱早期的表达量,而复水6h后表达量降低至对照（干旱处理前）水平。可见,PmSAMS基因的表达涉及糜子响应干旱胁迫及干旱后复水过程,可能是糜子抗旱节水的关键基因。该基因的克隆为进一步探讨其应用于农作物抗旱节水性的遗传改良奠定了基础。

山西省大豆地方品种与选育品种农艺性状及SSR标记遗传多样性比较分析

以山西省地方品种和选育品种为材料,对其质量性状、数量性状及SSR标记进行了遗传多样性分析,旨在探明地方品种与选育品种之间遗传多样性的差异,为山西省大豆品种资源的研究与利用提供理论依据。结果表明,184份选育品种和180份地方品种在8个质量性状、5个数量性状上都存在较广泛的遗传多样性。选育品种与地方品种相比,遗传多样性较低。在质量性状方面,选育品种的籽粒颜色、生长习性变异性呈下降趋势,而脐色和茸毛色都表现出增加的趋势;在数量性状方面,除粗蛋白低于选育品种外,地方品种的变异程度高于选育品种。对两类品种各13份材料进行SSR分析,结果表明,45个SSR位点基本可以将地方品种和选育品种分开,表明地方品种和选育品种在分子水平上也发生了一定的分化,但地方品种的遗传多样性要高于选育品种。表型和分子检测结果都表明,山西大豆品种的选育在一定程度上降低了遗传多样性。

糜子抗旱及复水相关基因的cDNA-AFLP差异显示

以糜子抗旱种质为实验材料,采用cDNA-AFLP技术分析四叶期糜子幼苗叶片在干旱、复水与对照等条件下的基因表达差异。选取了36个引物组合(6个荧光标记TaqⅠ引物×6个非荧光标记MseⅠ引物)进行选择性扩增,结果表明,这些引物组合都有很好的扩增效果,在三种处理之间均能扩增出表达模式不同的差异片段。随机选取了8个干旱特有和4个复水特有的差异片段进行了克隆测序。利用NCBI的Blastn进行序列的dbEST比对结果表明,12个EST序列中有2个分别与小麦、玉米的EST序列有较高的相似性,其余10个与已知EST序列的同源性都很低,可能为新的糜子抗旱相关基因。用Blastx与Genebank的非冗余蛋白数据库进行比较结果表明,其中的一个序列(DR007245)与N-乙酰葡萄糖胺-N-乙酰胞壁酸五肽(UDP-N-acetylglucosamine--N-acetylmuramyl-(Pentapeptide))的同源性较高,两个序列(DR007249,DR007250)与水稻的反转录转座子蛋白具有较高的同源性,反转录转座蛋白在植物抗旱、耐盐等抗逆境方面有重要作用。另外还有两个序列(DR007251,DR007252)与两种假定蛋白同源性较高。

两个与盐和赤霉病菌胁迫相关的小麦糖基转移酶基因的克隆与表达

在植物体内,糖基转移酶通过参与多种物质的糖基化而在植物抗逆境方面起着重要作用。为了解小麦糖基转移酶基因响应病原菌和盐胁迫的分子机制,文章分离了两个小麦糖基转移酶基因(TaUGT1,TaUGT2)。这两个基因均编码496个氨基酸,cDNA序列相似性为90%。它们均含有一个内含子,分别为335bp(TaUGT1)和324bp(TaUGT2)。序列比对分析表明,TaUGT1和TaUGT2与尿苷二磷酸葡萄糖醛酸/尿苷二磷酸葡萄糖转移酶(UDP-glucoronosyl and UDP-glucosyl transferase)基因同源性最高,且都含有PSPG(Putative secondary plant glycosyltransferase)保守结构域。Real-time PCR表达分析显示,TaUGT1受赤霉病菌抑制表达,而TaUGT2受赤霉病菌诱导表达;在高浓度NaCl胁迫下,TaUGT1和TaUGT2的相对表达量分别为对照的2.87及4.56倍,差异达到极显著水平。以上结果表明,TaUGT2可能与小麦赤霉病抗性有关,而TaUGT1和TaUGT2可能共同参与了小麦对盐胁迫的响应。

抑制差减杂交分离赤霉病菌诱导的小麦特异表达基因

为了全面探索小麦赤霉病抗性机理，以抗赤霉病小麦品种‘苏麦3号’及其感病的近等基因系（Hw04）为实验材料，构建了一个‘苏麦3号’受赤霉病菌诱导表达的正向差减杂交文库。随机选取了141个阳性克隆测序，共获得133条通读EST。将获得的EST去除载体及接头序列后，利用CAP3软件进行聚类分析，133条EST被聚成90个序列重叠群（contigs），片段大小介于106-643bp间，平均长度为274bp。利用NCBI的Blastx软件对序列进行蛋白序列同源性比对，结果显示76条序列在蛋白数据库中可以找到同源序列，功能涉及能量代谢、物质代谢、疾病／防御、转录及细胞结构等。其中以能量及物质代谢相关的基因数量最多，分别占总EST的21．1％及17．1％；其次是与抗病及防御反应有关的EST，数量占总EST的15．8％。进一步的分析表明与抗病及防御相关的EST功能主要涉及抗氧化、细胞解毒及相关物质的代谢。

小麦与赤霉病菌互作的分子机理研究进展

为了让小麦科技工作者对小麦与赤霉病菌互作的分子机制有一个全面的了解,从小麦赤霉病抗性的遗传规律、抗性基因的分子定位、互作过程中寄主相关的防卫反应基因、赤霉病菌的致病机理及抗病转基因等方面进行了综述。小麦赤霉病抗性是由2-3个主效基因和几个微效基因决定的数量性状,在3BS、5A、6BS等染色体上均发现了与赤霉病抗性相关的QTLs。其中相关的分子标记可以直接用于小麦抗赤霉病的分子标记辅助选择。运用双向电泳、cDNA文库构建、抑制差减杂交文库构建等方法已经分离到很多受赤霉病菌诱导的抗病相关蛋白（或基因）,如：-β1,3-葡聚糖酶、病程相关蛋白、细胞色素P450及几丁质酶基因等。通过小麦转基因,已经获得了小麦对赤霉病菌的初步抗性。但是这种抗性只是在一定程度上减轻或延迟赤霉病菌的侵染,而最直接的小麦抗赤霉病基因还有待于发掘和验证。

糜子干旱后复水过程中基因表达谱的初步分析

为探索在干旱后复水条件下糜子抗旱种质的基因表达特点,寻找与其复水后快速恢复生长相关的基因,利用抑制消减杂交(Suppressive subtraction hybridization,SSH)技术,以糜子干旱后复水处理叶片的cDNA为tester,干旱胁迫处理叶片的cDNA为driver,构建了一个抑制消减杂交文库。在文库中随机选取100个克隆(插入片段≥250 bp)测序,所获序列去除载体、引物及接头序列后,利用NCBI的BLAST序列比对分析软件分别对GenBank的dbEST数据库和非冗余蛋白数据库进行序列比对分析。序列同源性分析显示,文库中序列的同源基因主要以与新陈代谢、能量代谢、转录、蛋白加工、细胞信号转导及细胞组分生物合成相关的基因为主,其中以新陈代谢及细胞组分生物合成相关的基因数最多,分别占到与已知蛋白同源的EST的22.4%和10.3%。表明植物在干旱后复水条件下产生一系列的信号传导,同时启动相应的转录机制,激活响应基因的表达,以适应逆境的改变。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解菌的分离和鉴定

【目的】分离筛选能够降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的细菌,以期能在该毒素的生物解毒处理中得到应用。【方法】用高产毒禾谷镰刀菌F-25接种灭菌的小麦籽粒,培养后获得DON毒素;然后以DON毒素为唯一碳源进行DON毒素降解菌的驯化富集培养,得到能够降解DON毒素的混合菌群,逐一对分离到的细菌进行DON毒素降解能力检测,得到能够降解DON毒素的菌株。【结果】筛选得到的菌株DDS-1对液体培养基中的DON毒素的降解能力达95%以上,显著高于其它菌株;从形态、生理生化特性以及16S rDNA序列进行分析,DDS-1菌株初步鉴定为徳沃斯氏菌Devosia sp.;把DDS-1添加到小麦饲料中后,饲料中的DON毒素降解率达到75.47%。【结论】选出的DON高效降解菌株徳沃斯氏菌,不但对液体培养基中的DON毒素具有很好的降解作用,对饲料中DON毒素也有很好的降解效果。这为真菌毒素的生物脱毒处理提供了可行的方法。

中国大豆种质抗SCN基因rhg1位点SSR标记等位变异特点分析

利用与抗大豆胞囊线虫病主效基因rhg1紧密连锁的SSR标记Satt30 9分析 6 34份中国大豆种质 ,以 2 1份美国种质为对照 ,目的是明确我国抗大豆胞囊线虫病种质资源的特点 ,为大豆抗胞囊线虫病种质资源鉴定及抗线育种提供依据。 14 9份免疫或高抗种质和 4 95份感病种质共鉴定出 6个等位变异 ,其中介于 134bp和 14 9bp之间的Satt30 9- 5为新等位变异 ,具有该等位变异的陕西三股条黑豆和山西忻县小黑豆分别免疫和中抗 1号生理小种。对不同等位变异、不同抗性等级和抗不同生理小种种质的分析表明 :92 .13%的感病种质具有 12 5bp、131bp或 14 9bp等位变异 ,抗病种质在各等位变异都有分布 ,但以 12 8bp和 134bp为主 ,在具有这两个等位变异的种质中 ,有 72 .4 6 %表现为抗病 ,且 77.2 7%的免疫种质、87.6 9%的双抗种质和 10 0 %的三抗种质都具有这两个等位变异。16份具有 12 8bp等位变异的种质中有 14份来自山西省 ,另有 2份是黑龙江省和河北省的育成品种 ,推测山西省可能是Satt30 9位点 12 8bp等位变异种质的起源地。本研究结果可为大豆抗胞囊线虫病育种的抗源选择提供一定的参考依据。

YS型小麦温敏雄性不育系A3017控温条件下的花粉育性比较

为了研究温敏不育系在可育和不育温度条件下的花粉发育情况，通过人工控温的方法对YS型小麦温敏不育系A3017-310和A3017-312减数分裂期分别处在不育和可育温度条件下的花粉育性进行了分析．结果表明，不育温度条件（12～16℃）下，花粉粒多数败育，I2-KI染色不着色，染色不均匀，约1／3花粉粒发育至单核中后期或双核早期发生败育，大部分花粉粒发育到二核后期或三核期发生败育（染败），两个系的花粉粒碘染败育率分别为98．7％和99．0％，花粉萌发势分别为0．7％和0．5％，花药不开裂、不散粉，自交结实率均为0；可育温度条件下（正常分蘖穗为18～22℃，再生分蘖穗为20～25℃），花粉粒多数正常，花药能正常开裂、散粉，花粉粒在这两种可育温度条件下碘染的败育率无差异，均约为20％．花粉萌发势随温度升高而增加，A3017—310由60．7％增为71.5％。A3017-312由27．4％提高为63．1％;自交结实率（国际法）为34．6％～113．7％。A3017—310和A3017—312株系来源于同一组合的F6代，它们在不同的可育条件下，育性恢复程度有所不同，表明YS型温敏不育系在育性转换为可育后控制自交结实的遗传机制较为复杂。

糜子抗旱节水相关基因PmMYB的克隆及表达分析

根据在糜子抗旱节水分子基础研究中获得的一个糜子MYB基因的EST序列,以其序列及水稻MYB18基因的序列为基础设计引物,扩增得到1739bp的全长基因组序列。序列分析表明,其包含121bp（347～467bp）和93bp（599～691bp）的两个内含子,3个外显子;全长cDNA序列为1525bp,其中3′非翻译区为212bp,5′非翻译区为41bp,编码区为1272bp,共编码424个氨基酸,C-端存在一个丝氨酸（Ser,S）丰富区。该基因具有两个典型的MYB类转录因子基因的DNA结合区（DNA-binding domain）,分别为13～63、66～114位氨基酸,属于典型的R2R3-MYB转录因子。对其与水稻、玉米、火炬松、拟南芥、辣椒、陆地棉、大麦及茄子等9种植物的MYB基因的R2、R3重复区的氨基酸序列多重比较,表明R2R3重复序列在植物中具有较高的保守性;基于氨基酸序列的编码区系统进化树分析表明,不同植物的MYB基因遗传分化很大,序列相似性为32%～84%,其中糜子MYB基因与水稻的MYB18相似程度最高（84%）,与大麦和玉米的相似性分别为46%和41%。通过半定量RT-PCR对其表达模式分析表明,该基因在水分胁迫和干旱后复水条件下上调表达,与糜子抗旱节水紧密相关。该基因的克隆为进一步探讨利用该基因改良其他植物的抗旱节水性奠定了良好的基础。

YS型小麦温敏雄性不育系A3017育性相关基因的SSH分析

以人工气候箱控温条件下YS型小麦温敏不育系A3017的不育幼穗和可育幼穗为材料,分别构建了不育和可育条件下基因特异表达的抑制消减杂交cDNA文库.在两个库中分别随机挑选100个阳性克隆进行测序,经BLAST序列比对分析,共获功能已知的EST 78条.比较发现,不育条件下与细胞质相关的基因表达数量(63.4%)远高于可育条件下的基因数量(35.1%),参与蛋白质合成、蛋白质修饰/加工/储藏、转运和信号传递过程基因的比例也均高于可育条件下的,而参与能量代谢过程基因的比例则明显偏低.分析认为,在不育和可育条件下的基因表达差异可能是导致温敏雄性不育系育性变化的关键,这为进一步从分子基础上揭示YS型小麦温敏雄性不育系育性转换机制奠定了基础.

YS型小麦温敏不育系育性转换基因的cDNA-AFLP分析

对YS型小麦温敏雄性不育系A3017不育与可育条件下不同发育时期的幼穗提取mRNA,进行cDNA- AFLP表达差异分析,64对引物组合获得差异片段1160个。统计分析表明,单核期表达的差异片段数最多,认为这一时期是育性转换的关键时期。对其中12个在不育或可育条件下表达的差异片段进行同收、克隆、测序,经 BLAST序列比对分析表明,可育条件下的4个EST与物质转运和能量代谢过程的铁转运蛋白1和ATP合酶α亚基,基因表达调控的反转录转座子跳跃多聚蛋白和转座子相似序列同源。不育条件下有5个EST与细胞内信号传导的ZCCT转录因子和光敏色素蛋白,基因表达调控的转座酶、染色体浓缩因子和亮氨酸富集蛋白的编码基因同源。结果表明YS型小麦温敏雄性不育系A3017的育性转换与细胞内基因表达调控、物质和能量代谢及信号传导过程有关。

中国冬、春性小麦品种遗传多样性的微卫星标记分析

为了明确中国目前各麦区育成品种的遗传基础，为育种工作者提供育种材料的遗传变异信息，利用141对SSR标记对中国冬、春麦区的73份小麦材料进行了遗传多样性分析，共检测出513个等位位点，每对引物等位变异数为2～10，平均为3．61；多态性信息指数（PIC）为0．08～0．88，平均为0．60。遗传距离（GD）为0．12～0．48，平均为0．35。聚类分析结果显示，73个品种聚为四大类11个组，在一定程度上反映了供试材料的冬春性差异及品种之间的亲缘关系。对7个部分同源群多样性的比较结果表明，4和6两个部分同源群多样性较低。并对小麦品种遗传基础狭窄的原因以及拓宽中国小麦品种遗传基础的可能途径进行了讨论。

条锈菌诱导的抗锈小麦种质的基因表达分析

以条锈菌接种前后的抗条锈病种质N 95175的小麦幼苗叶片为材料,利用抑制消减杂交技术,构建了条锈菌接种初期小麦抗性种质叶片的SSH-cDNA文库。通过对文库中随机选取的50个阳性克隆提取质粒,进行测序,共获得已知功能的EST序列14条,如蛋白激酶、锌指蛋白、细胞色素P 450和OM T 1等抗病相关基因,它们涉及植物的信号传导、转录调控、丙烷代谢途径及防卫反应等方面。

来自莫迦小麦(T. macha)的T型恢复基因Rf3和K型不育基因rfv1的SSR标记分析

为了建立非1B/1R类型K型小麦细胞质雄性不育系的分子标记辅助选育技术体系,对基础遗传材料Tm3314来自莫迦小麦1BS染色体的T型恢复基因Rf3和K型不育基因rfv1进行了分子标记定位。以Tm3314和T型不育系T504A的杂交F2代作为定位群体,利用分离集团分析法(BSA),从1BS染色体上10对SSR引物中筛选出与目的基因连锁的2个SSR标记Xbarc8和Xgwm18。然后结合(T504A/Tm3314)F2群体在T型细胞质下的育性分离情况和F2可育株与K型不育系K119A测交所得的K型细胞质下的育性结果,运用Mapmaker 3.0b软件进行连锁分析,结果表明,Xbarc8和Xgwm18与Rf3基因的遗传距离分别为5.5 cM和8.1 cM,与rfv1基因的遗传距离分别为22.2 cM和19.6 cM,且2个SSR标记位于两个育性基因之间。

转基因小麦田土壤细菌16S rDNA V3片段的DGGE分析

为长期监测转基因作物对土壤微生物菌群变化的影响提供可靠的试验方法。以检测转基因小麦田土壤细菌菌群变化为例,利用细菌特异性引物,扩增得到了土壤细菌16S rDNA V3可变区片段;通过变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE),分析PCR扩增得到的V3可变区片段;根据电泳条带的变化情况评价转基因小麦对土壤环境微生物的安全性。结果表明该方法所提取的DNA,可以不经过纯化直接进行PCR扩增等后续试验;DGGE图谱中条带清晰。该方法可作为长期监测土壤微生物种群变化的试验手段。

转基因抗病小麦的环境生物安全研究进展

转基因小麦研究已被列入国家科技重大专项,对我国小麦生产能力的进一步提高具有重要意义。建立小麦转基因安全评价体系,对转基因小麦的安全风险进行系统研究,有助于厘清转基因小麦的安全忧虑,促进转基因小麦的产业化。本文对转基因抗病小麦生物安全相关的主要研究进展进行了评述,阐述了目前国际上小麦转基因研究的主要目标基因、安全性及其评价方法,有助于建立我国转基因小麦的安全评价技术体系,保障转基因小麦的健康发展。

抑制性消减杂交技术(SSH)及其在植物抗病性机制研究中的应用

抑制性差减杂交是建立在抑制PCR及差减杂交技术基础上的,研究未知基因表达的一门技术。该方法具有灵敏性高、操作简单、稳定、可靠等特点,适合于从整体水平研究基因的差异表达。笔者就该技术的原理、发展、优缺点及其在植物抗病性机制研究中的应用进行了综述。

强光诱导小麦叶片花青素积累的研究

以‘小偃54’、‘京411’等67份小麦品种(系)为试材,对强光诱导小麦叶片花青素积累的现象及品种间变异进行分析,以探讨花青素在小麦响应强光过程中的生理与分子机制。结果显示,‘小偃54’和‘京411’分别经25℃强光处理24 h和48 h叶片花青素含量大幅增加,而15℃和30℃强光处理增幅较小;强光处理48 h后,‘京411’的花青素含量高达7.2μg.g-1FW,约为‘小偃54’的10倍。对‘京411’而言,花青素含量随叶位自下而上递减,并且按叶鞘、叶基部、叶中部和叶尖的部位依次递减。强光处理24 h和48 h后能诱导‘小偃54’和‘京411’的PAL活性增强。强光处理48 h后,紫色胚芽鞘类品种的花青素含量高于绿色胚芽鞘类品种,不同品种强光下的花青素吸收峰均在520 nm处。研究表明,强光下叶片花青素含量升高可能是紫色胚芽鞘类小麦品种抗强光的一种机制。