人类X盒结合蛋白1的融合表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的:将以构建的未剪接型X盒结合蛋白1(XBP1u)的原核表达,纯化及人XBP1多克隆抗体的制备.方法:重组质粒pET32a-XBP1u转化入宿主菌E.coliBL2l(DE3),在IPTG诱导下表达,经SDS-PAGE鉴定正确后,用Ni2+-NTA柱式亲和层析法纯化蛋白,将纯化后的目的蛋白经透析袋复性后进行蛋白质定量,再以此蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔,末次免疫后心脏取血,采用ELISA法检测抗血清效价;免疫印迹和免疫组化法检测兔抗XBP1u血清的特异性.结果:XBP1u蛋白为包涵体表达,包涵体裂解后经过纯化、复性进行免疫,得到抗血清的效价大于1∶64000,免疫印迹结果出现特异Mr33×103XBP1u条带,免疫组化法在兔肝细胞中成功检测到XBP1u的表达.结论:成功表达和纯化人XBP1u蛋白,并得到高特异性、高效价兔抗XBP1u多克隆抗体.

PBL互动式教学模式在留学生教学中的探索与实践

结合留学生教学的现状、笔者在美国纽约大学的学习体会以及几年来的留学生教学经验,阐述了在留学生教学中开展PBL教学的必要性,进而提出了适合留学生教学的PBL教学具体方案。

大单元教学法在初中语文自学指导设计中的应用

语文学科是初中阶段学校教育的重要学科之一,随着素质教育与教学改革的日益深化,学生的语文学习能力一直受到广泛关注,而课堂学习方式也逐渐转变为主动性教学。在当前的语文教学中,激发学生的学习兴趣、培养学生的自主学习能力是重中之重。若想培养学生开展自主学习,最大化地提升学习效果,引导学生养成自主思考及自主探究的能力,其有效途径是教师应用大单元教学法对学生开展自学指导设计,实现对学生自主学习能力的全面提升。

转录因子XBP1S对人肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨人剪接型X盒结合蛋白1(X-box binding protein1spliced,XBP1S)对肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响。方法:应用衣霉素(tunicamycin,Tm)和毒胡萝卜素(thapsigargin,Tg)建立HepG2细胞的内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)模型。将XBP1S真核表达载体pcDNA3.1(-)-XBP1S和靶向XBP1S的RNA干扰质粒pSUPER-XBP1S转染HepG2细胞,MTT法检测细胞的增殖能力,荧光显微镜下观察细胞的形态学变化,FCM法检测细胞凋亡率,Western印迹法检测caspase12的表达。结果:转染pSUPER-XBP1S可有效抑制细胞增殖,而转染pcDNA3.1(-)-XBP1S可促进细胞增殖。荧光显微镜下可见Tm处理组细胞出现细胞凋亡的形态学改变,进一步下调XBP1S的表达可使这一改变增强。对照组、Tm组、Tm+pSUPER-XBP1S转染组和Tm+pcDNA3.1(-)-XBP1S转染组细胞的凋亡率分别为5.21%、41.51%、52.15%和35.87%,差异有统计学意义(P<0.05)。HepG2细胞中caspase12的表达,Tm组高于对照组,Tm+pSUPER-XBP1S转染组高于Tm组,Tm+pcDNA3.1(-)-XBP1S转染组低于Tm组。结论:XBP1S可以促进肝癌HepG2细胞增殖,抑制或促进XBP1S表达可调节ERS介导的细胞凋亡。

靶向XBP1S的RNA干扰质粒对细胞增殖的影响

目的 构建靶向人XBP1S的siRNA真核表达载体（pSUPER-XBP1S）并观察其对人HeLa细胞和HepG2细胞增殖能力的影响.方法 设计并合成针对XBP1S基因的siRNA,退火成互补双链后克隆至真核表达载体pSUPER构建重组质粒,并将其转染入HeLa细胞和HepG2细胞中.采用RT-PCR检测转染前后XBP1S在HeLa细胞和HepG2细胞中的转录,Western印迹检测转染前后XBP1S蛋白的表达;MTT法、细胞计数检测重组质粒对HeLa细胞和HepG2细胞增殖能力的影响.结果 重组质粒能有效地抑制HeLa细胞和HepG2细胞中XBP1S基因的转录和表达;转染HeLa细胞和HepG2细胞后,细胞增殖抑制率及细胞增殖数与对照组比较,差异有统计学意义（P〈0.05）.结论 成功构建了靶向人XBP1S的siRNA表达载体pSUPER-XBP1S,并且有效的抑制了HeLa细胞和HepG2细胞中XBP1S的转录和表达,有效抑制了细胞的增殖能力.

鄂尔多斯盆地南部玉都走滑断裂带构造特征及其对油气成藏的控制

为加深对鄂尔多斯盆地内部走滑断裂结构构造特征的认识,通过相干切片技术和三维地震资料精细解释,对鄂尔多斯盆地南部镇泾-彬长地区玉都走滑断裂带进行了详细刻画,明确了玉都走滑断裂带平面和剖面活动性特征、同时结合流体包裹体定年和前人研究的成果,探讨了玉都走滑断裂带形成演化过程及其与油气成藏的关系.研究表明:(1)根据玉都走滑断裂带平面和剖面特征,以三叠系底界面(T8)为界,可将研究区地层分为上下两个构造层,玉都走滑断裂带在上下两个构造层中具有明显差异.(2)玉都走滑断裂带具有明显的分层分段差异性,断裂活动特征在不同层段之间差别较大.其在加里东-海西期和燕山-喜山期的应力作用下至少经历三期构造走滑活动,分别为加里东晚期-海西早期左旋走滑活动、海西晚期右旋走滑活动、燕山期-喜山期左旋走滑活动.(3)走滑断裂及其伴生裂缝对油气成藏有重要的控制作用,研究区油气成藏主时期为早白垩世晚期,与燕山期玉都走滑断裂带活动时间相吻合.

转录因子XBP1S基因表达谱差异分析

目的 应用基因表达谱芯片技术了解XBP1S在肝细胞中可能上调或下调的基因,了解其可能的调节功能线索.方法 构建pcDNA3.1（-）-XBP1S真核表达载体,转染HepG2细胞,同时以空载体pcDNA3.1（-）处理相同细胞系作为对照.48 h后制备细胞裂解液,提取mRNA,应用基因表达谱芯片技术对差异表达mRNA进行检测和分析.结果 构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误,提取高质量的总mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行基因表达谱芯片技术分析.经过差异基因表达谱的筛选,发现HepG2细胞转染XBP1S以后,有38个基因表达水平显著上调,30个基因表达水平显著下调.结论 成功构建XBP1S的真核表达载体pcDNA3.1（-）-XBP1S,运用基因表达谱芯片技术成功筛选了XBP1S转染细胞后的差异表达基因,这些差异表达基因包括细胞周期、蛋白质的翻译合成及运输、能量代谢、体内免疫调节、细胞凋亡及细胞内的信号转导等方面起重要作用及肿瘤发生相关的基因,为进一步阐明XBP1S可能存在的调控机制及XBP1S蛋白可能的生物学功能提供理论依据.

X盒结合蛋白1-u的原核表达及纯化

目的构建X盒结合蛋白1-u(XBP1-u)基因原核表达质粒,表达并纯化XBP1-u蛋白。方法利用RT-PCR技术从肝癌细胞HepG2中扩增XBP1-u基因,先插入中间载体pGEM-Teasy,再将其克隆至原核表达载体pET32a,构建重组原核表达质粒pET32a-XBP1-u,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经Ni-NTA树脂柱亲和层析纯化后,进行Western blot鉴定。结果测序分析证实,克隆入pET32a的XBP1-u序列与GenBank中登录的XBP1-ucDNA序列一致。IPTG的最佳诱导浓度为0.5mmol/L,最佳诱导时间为6h。目的蛋白以包涵体形式表达,相对分子质量约为33000。纯化的蛋白经SDS-PAGE分析显示单一条带,且具有良好的反应原性。结论已成功构建了XBP1-u基因原核表达质粒,表达并纯化了XBP1-u蛋白,为XBP1-u在肿瘤发病中的作用机制及在应激性疾病临床治疗中的研究奠定了基础。

自剪切多肽P2A对自然杀伤细胞的高效诱导扩增作用的研究

目的改进现有过继性人自然杀伤(NK)细胞体外诱导、分化及扩增方法,实现高效定向分化及大量扩增NK细胞的目的。方法利用自剪切多肽P2A连接IL-15和4-1BBL基因,通过慢病毒感染和药物筛选的方法制备稳定表达IL-15和4-1BBL的K562滋养层细胞株。该方法可刺激人PBMC细胞向NK细胞分化及高效增殖。实验结果以x±s表示并用两样本t检验进行比较。结果经该方法培养的CD3-CD16^+56^+NK细胞增殖倍数达到(4480.43±37.80)倍;CD3-CD16^+56^+NK细胞纯度达到94.79﹪;细胞内表达IFN-γ和TNF-α的NK细胞比例为(63.07±3.37)﹪和(54.85±2.04)﹪,分别高于对照组(16.28±2.86)﹪和(14.53±1.15)﹪(t=62.25,22.66,P均<0.01);细胞分泌至培养上清液中的IFN-γ和TNF-α浓度为(111.39±6.95)pg/ml和(32.76±3.23)pg/ml,分别高于对照组(44.99±4.74)pg/ml和(11.09±2.45)pg/ml(t=20.56,7.21,P均<0.01);在体外,该方法培养的NK细胞对K562细胞的杀伤效率为(78.52±7.36)﹪,高于对照组(48.53±6.66)﹪(t=11.56,P<0.01);对H520细胞的杀伤效率为(65.03±3.27)﹪,高于对照组(35.85±3.99)﹪(t=11.35,P<0.01)。结论利用自剪切多肽P2A构建稳定高表达的IL-15和4-1BBL的K562滋养层细胞株,从而提高了NK细胞增殖倍数、纯度和细胞毒性。