突变型pAAV-CD151真核表达载体的构建与鉴定

目的构建CD151两种突变体,为研究CD151的功能及CD151-整合素复合体的功能奠定基础。方法以pAAV-CD151质粒为模板,采用定点突变技术,构建整合素α3β1/α6β1结合缺陷QRD突变体(pAAV-CD151-QRD-AAA194-196突变体)和CD151囊泡运输基序缺陷的ARSA突变体(pAAV-CD151-YRSL-ARSA245-248突变体),并包装两种突变体的重组腺相关病毒。结果经过测序鉴定成功构建了CD151的QRD和ARSA突变体,亦成功包装了重组腺相关病毒,病毒滴度符合本实验要求。结论成功构建CD151两种突变体并包装成重组腺相关病毒,为进一步研究CD151的功能和作用机制奠定了基础。

CD151基因对前列腺癌细胞增殖、转移的促进作用及其机制

目的研究人前列腺癌细胞株PC3细胞转染CD151基因后其增殖和迁移能力的变化及机制。方法用FuGENE HD分别将质粒pAAV-CD151(CD151组)、pAAV-GFP(GFP组)转染入PC3细胞,并设加入等体积PBS的对照组。48 h后采用Western blot检测CD151蛋白、磷酸化细胞外信号调节激酶(ERK)和总ERK的表达。采用MTT法检测CD151基因对PC3细胞增殖的影响,采用Boyden趋化小室研究CD151基因对PC3细胞迁移的影响。结果与对照组和GFP组相比,CD151组的CD151蛋白表达水平明显增加(均P<0.05);磷酸化ERK的表达量亦明显高于其它两组;细胞增殖能力比对照组和GFP组明显增高[相对吸光度值分别为:(0.245 7±0.006 4)vs(0.175 2±0.007 4)、(0.179 0±0.008 4)];细胞迁移数(107.8±9.6)亦显著高于对照组和GFP组[(53.0±7.6)和(57.0±5.2),P<0.05]。结论 CD151在前列腺癌细胞的增殖、转移中起着重要作用,是肿瘤转移的重要分子基础,其分子机制可能是CD151对ERK信号通路的激活。

利多卡因冠脉内注射心室颤动模型的建立

心脏骤停（caridiac arrest,CA）是心脏病危重并发症之一,其80%以上是由心室颤动（ventricularfibrillation,VF）所致。冠心病及其它心脏病、精神和躯体遭受巨大冲击都可导致心脏骤停。本实验旨在通过药物和介入方法建立大动物室颤模型,为临床心脏骤停后的心肺复苏研究提供可靠的室颤动物模型。

阵发性快速性心房颤动患者采用胺碘酮复律的量效关系与安全性分析

目的观察注射不同负荷剂量胺碘酮对阵发性快速性心房颤动复律的疗效与安全性。方法回顾性收集78例在急诊室或者住院期间出现阵发性快速性心房颤动的患者。分为150mg组和300mg组。比较心房颤动复律的比率和不良反应率。结果用药后10min及6h内,300mg组的心房颤动复律的效率(36.0%、88.0%、96.0%)明显高于150mg组(11.3%、60.4%、83.0%)。两组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。150mg组出现静脉炎8例,复律后出现一过性显著窦性心动过缓2例。300mg组出现静脉炎2例,复律后出现一过性显著心动过缓1例,两组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。两组均未见二度或三度房室传导阻滞、未见窦性停搏、未见新发心力衰竭。结论胺碘酮300mg负荷量的复律方案优于胺碘酮150mg负荷量方案,副作用无增加。

胺碘酮用于腹部外科术后心房颤动复律的量效关系

目的对比观察静脉注射不同负荷剂量胺碘酮对行腹部外科术后发作阵发性心房纤颤的患者转为窦性心律的量效关系与安全性。方法28例腹部外科术后发作阵发性心房纤颤患者随机分成胺碘酮150mg负荷量组（14侧）和胺碘酮300mg负荷量组（14例）。观察10min、6h、24h内房颤转为窦律的比率和不良反应率。结果胺碘酮150mg负荷量组10min内转律1例，6h内总转律6例，24h内总转律10例．胺碘酮300rag负荷量组10min内转律5例，6h内转律11例，24h内转律13例。两组比较，差异有显著性。两组均未见复律后严重心动过缓、窦房和房室阻滞、窦性停搏等。结论静脉应用胺碘酮300mg负荷量组对阵发性房颤转为窦性心律的有效率优于静脉应用胺碘酮150mg负荷量组，尤其是用药10min内房颤转为窭性心律的有效率，并且不良反应无明显增加，安全、有效，值得推广。

经口气管插管、复合麻醉下结扎冠状动脉建立小型猪心肌梗死模型

目的:探讨制作小型猪心肌梗死模型安全、稳定的方法。方法:小型猪20头,在经口气管插管、复合麻醉下结扎左冠状动脉前降支建立小型猪急性心肌梗死模型。术中心电监护,术后3d行冠状动脉造影检查,8周取心肌组织病理检查。结果:心电监护示结扎瞬间心电图即表现ST段弓背向上抬高,冠状动脉造影见左冠状动脉前降支远端完全闭塞,病理切片见梗死心肌为大量结构紊乱的纤维组织所取代。结论:经口气管插管、复合麻醉下结扎冠状动脉可成功建立小型猪心肌梗死模型,动物死亡率低。

CD151激活PI3K/Akt/eNOS通路并促进小型猪缺血心肌血管生成

目的:磷脂酰肌醇-3(羟基)激酶(PI3K)信号转导途径在生长因子促血管生成过程中起重要作用。四跨膜蛋白分子CD151如何参与PI3K信号转导途径尚不清楚。文中探讨重组腺相关病毒(rAAV)介导CD151转染心肌梗死小型猪模型对心肌血管生成的影响及机制。方法:结扎左冠状动脉左前降支建立小型猪心肌梗死模型,构建并包装绿色荧光蛋白、CD151、antiCD151重组腺相关病毒,分别注射至缺血心肌组织;同时设置正常对照组。8周后用vWF相关抗原免疫组化染色并计数注射部位心肌微血管数目,Western blot检测CD151及相关信号通路分子蛋白表达。结果:术后8周rAAV-CD151组心肌组织CD151蛋白表达明显高于正常对照组、rAAV-GFP组和rAAV-反义CD151组(P<0.05)。rAAV-CD151组微血管密度[(30.20±2.35)个/视野]与正常对照组[(7.60±1.14)个/视野]、rAAV-GFP组[(14.40±1.34)个/视野]相比显著增加,rAAV-反义CD151组微血管密度[(7.20±1.30)个/视野]则明显低于其他手术组(P<0.05)。CD151表达增高促进了PI3K、p-Akt、p-eNOS的激活,促进NO的生成。结论:重组腺相关病毒携带CD151基因能有效转染心肌组织,明显增加微血管密度并激活PI3K/Akt/eNOS通路。

CD151-整合素α3/α6复合体促人脐静脉内皮细胞增殖及其分子机制

目的:研究CD151-整合素α3/α6复合体对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的影响及机制。方法:将重组腺相关病毒介导CD151基因(rAAV-CD151)和整合素α3/α6结合缺陷的突变CD151基因(rAAV-CD151-AAA194-196)转染HUVEC。免疫共沉淀检测CD151-整合素α3/α6复合体;Western blot检测CD151、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、丝/苏氨酸蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)的表达;MTT法检测CD151对HUVEC增殖的影响。结果:CD151组和CD151突变组的CD151蛋白表达水平较对照组、绿色萤光蛋白组(GFP组)明显增加(P<0.05)。CD151组的CD151-整合素α3/α6复合体、PI3K和p-Akt表达水平明显高于对照组和GFP组(P<0.05);CD151突变组的CD151-整合素α3/α6复合体、PI3K和p-Akt表达水平明显低于对照组和GFP组(P<0.05)。CD151组的细胞增殖明显高于对照组和GFP组,CD151突变组的细胞增殖能力最低。结论:过度表达CD151蛋白可以促进HUVEC的增殖,其机制是过度表达的CD151分子与整合素形成复合体增加,使PI3K和p-Akt表达增加。

Real time PCR检测L1-CAM在大肠癌中的表达及其临床意义

目的探讨L1细胞黏附分子(L1-CAM)在大肠癌中的表达情况及其与临床病理的相关性。方法应用实时荧光定量PCR检测浙江省人民医院58例大肠癌组织及其癌旁正常组织中L1-CAM的表达,分析L1-CAM在大肠癌中的表达及其与临床病理学特征和预后的关系。结果癌组织和癌旁正常组织L1-CAM m RNA表达差异有统计学意义(P<0.05)。癌组织L1-CAM m RNA表达与肿瘤分化程度、静脉侵犯、淋巴管侵犯、淋巴结转移、Dukes分期密切相关(均P<0.05),而与性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤类型无明显相关(均P>0.05)。结论 L1-CAM在大肠癌组织中高表达,并且与大肠癌的浸润、转移有关。

ICAP-1对脐静脉内皮细胞PI3K表达及细胞增殖的影响

目的研究整合素胞浆结构域关联蛋白-1(ICAP-1)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖及PI3K信号通路表达的影响,以进一步研究其生物学作用及其在血管形成中的作用机制。方法通过构建PCDNA3.1-ICAP-1质粒并转染HUVEC,采用MTT法测定HUVEC增殖化,WesternBlot检测ICAP-1及PI3K表达。结果PCDNA3.1-ICAP-1转染组ICAP-1和PI3K表达明显增加,PCDNA3.1-ICAP-1转染组与正常对照组、PCDNA3.1-GFP转染组比较表达差异有统计学意义(P<0.05)。PCDNA3.1-ICAP-1转染组较PCDNA3.1-GFP转染组和正常对照组细胞增殖能力增强,差异有统计学意义(P<0.05)。结论ICAP-1具有促进内皮细胞增殖的作用,ICAP-1可能通过上调PI3K表达,促进内皮细胞增殖达到促进血管新生的作用。

急性心肌梗死后血小板活化因子及脂蛋白相关磷脂酶A2的表达

目的探讨急性心肌梗死后不同时间血小板活化因子(PAF)和脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)的表达。方法选取2015年6月至2016年8月浙江省人民医院就诊的急性ST段抬高心肌梗死患者(STEMI组)50例,检测其入院即刻、24h、72h、1周及2周时的PAF、Lp-PLA2水平以及血常规,超敏C反应蛋白和生化指标,并与30例稳定性冠心病患者(稳定性冠心病)及30例健康体检者(对照组)比较。结果 STEMI组入院即刻白细胞、中性粒细胞百分比、血糖均显著高于稳定性冠心病组和对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。稳定性冠心病组患者LDL-C水平低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。PAF水平在急性心肌梗死后入院即刻最高,显著高于其他时段测值及稳定性冠心病组和对照组测值(均P<0.05)。STEMI组各个时间点Lp-PLA2水平与稳定性冠心病组、对照组比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。hs-CRP在STEMI组入院72h时最高,与STEMI组入院即刻、24h、1周、2周、稳定性冠心病组、对照组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。STEMI患者入院即刻中性粒细胞百分比与PAF水平存在相关性(P<0.05)。结论急性心肌梗死后PAF水平升高,以早期最为明显,Lp-PLA2无明显变化。

瑞舒伐他汀与阿托伐他汀对冠心病患者PCI术后血脂、同型半胱氨酸水平的影响

目的观察瑞舒伐他汀与阿托伐他汀对冠心病患者经皮冠状动脉介入(PCI)术后血脂、同型半胱胺酸水平的影响。方法回顾性分析2018年3月至9月在浙江省人民医院行PCI治疗的冠心病患者145例,分为瑞舒伐他汀组和阿托伐他汀组。比较两组患者治疗前,治疗1、12个月血清胆固醇和同型半胱胺酸水平、主要心血管不良事件(MACE)发生情况。结果两组患者与治疗前比较,治疗1、12个月低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平下降,高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平升高,差异均有统计学意义(均P<0.05);与阿托伐他汀组相比,瑞舒伐他汀组患者LDL-C水平下降、HDL水平升高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。治疗12个月两组患者LDL-C水平较治疗1个月有所上升(均P<0.05),但仍低于治疗前(均P<0.05)。治疗12个月两组患者同型半胱胺酸水平较治疗前有明显下降,差异均有统计学意义(均P<0.05)。两组患者随访期间MACE发生率差异无统计学意义(P>0.05)。结论瑞舒伐他汀较阿托伐他汀降低LDL-C和升高HDL-C的作用更强,两者均能够同等程度降低同型半胱氨酸。

质粒pAAV-HRE-CD151的构建和鉴定

目的为了增加CD151基因转染大鼠缺血心肌的效率和靶向特异性。方法以质粒pAAV-CD151为模板,采用克隆技术,构建一个含缺氧反应元件(hypoxia response element,HRE)和CD151基因序列的腺相关病毒载体,通过HRE促进CD151在大鼠缺血心肌的表达。结果经过测序鉴定成功构建了含缺氧反应元件的质粒pAAV-HRE-CD151。结论成功构建了pAAV-HRE-CD151质粒,为CD151治疗缺血性心血管病的靶向研究奠定了基础。

弹簧圈栓塞间隔支治疗肥厚型梗阻性心肌病的初步探讨

目的探讨弹簧圈栓塞冠状动脉室间隔支治疗肥厚型梗阻性心肌病(HOCM)的方法、效果与安全性。方法选取浙江省人民医院2018年1月至2021年8月行弹簧圈栓塞冠状动脉室间隔支治疗HOCM患者9例作为观察组,其中男5例,女4例,年龄43.5~49.7岁;并选取同期行经皮室间隔无水酒精化学消融术(PTSMA)患者30例作为对照组,其中男20例,女10例,年龄42.8~48.6岁;对比两组靶血管残余血流、左心室流出道压力阶差(LVOTG)变化、临床症状改善和并发症发生情况。结果观察组靶血管栓塞支数(2.4±1.2)支,对照组靶血管消融支数(2.2±1.6)支差异无统计学意义(t=0.230,P>0.05),两组比较栓塞后靶血管残余血流差异无统计学意义(χ^(2)=0.975,P>0.05);观察组LVOTG与对照组LVOTG比较差异无统计学意义(t=0.112,P>0.05);术中胸痛发生率观察组无,对照组有12例(40%)术中剧烈胸痛予吗啡3 mg静脉推注后胸痛缓解,两组比较差异有统计学意义(χ^(2)=5.200,P<0.05);观察组术中未见心律失常发生,对照组有1例一过性三度房室传导阻滞、1例术中心室颤动予处理后好转;术后1个月临床症状改善与并发症发生率两组比较无统计学差异(χ^(2)=0.632,P>0.05)。结论弹簧圈栓塞冠状动脉室间隔支治疗HOCM,降低LVOTG,即刻效果显著,与PTSMA同样有效,胸痛副作用发生率低。

银杏提取物对急性冠脉综合征介入治疗后患者血小板活化因子的影响

目的探讨银杏提取物对急性冠脉综合征(ACS)介入治疗后患者血小板活化因子(PAF)的影响。方法2015年6月至2016年8月行择期经皮冠状动脉介入(PCI)治疗的ACS患者40例,术后随机分为观察组和对照组,每组20例。两组均于PCI术后常规双联抗血小板以及他汀调脂治疗。观察组加用天保宁(银杏叶提取物,19.2mg/片,36片/盒)1片/次,3次/d口服。术前、术后24h,术后2周检测PAF水平、超敏C反应蛋白(hs-CRP)和血小板聚集率。术前及术后2周进行心脏超声检查,术后2周观察主要心血管不良事件(MACE)。结果两组患者PCI术后24h的PAF水平,hs-CRP,血小板聚集率均较PCI术前升高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。PCI术后2周,观察组PAF水平、hs-CRP[(1667.46±390.98)p g/ml、(4.34±2.01)mg/L]均低于对照组[(1823.46±434.76)p g/ml、(7.09±4.78)mg/L],差异有统计学意义(均P<0.05)。PCI术后2周,观察组LVEF值与对照组及自身术前比较,差异有统计学意义(P<0.05),心绞痛发作观察组显著低于对照组(P<0.05)。结论银杏提取物可降低PCI术后PAF与hs-CRP表达,同时减少临床心绞痛的发生。

rAAV-CD151-AAA^194-196表达对大鼠缺血后肢血管新生的影响

目的观察CD151及其突变体在大鼠后肢缺血模型中的表达以及对血管新生的影响,进一步研究CD151促血管新生的分子机制。方法将实验大鼠随机分组,分别给予生理盐水,rAAV-GFP,rAAV-CD151和rAAV-CD151-AAA194-196(整合素α3/α6结合缺陷突变体),分点注射至大鼠左后肢肌肉组织内,基因转染1周后行股动脉切除术建立大鼠后肢缺血模型,假手术组不切除股动脉。建模5周后测定后肢皮肤温度,检测缺血肌肉组织毛细血管密度,Westernblot检测各组大鼠缺血肢体局部CD151的表达。结果术后5周,rAAV-CD151和rAAV-CD151-AAA194-196组的CD151蛋白及AAA194-196突变体蛋白表达水平明显高于其余各组(均P<0.05),rAAV-CD151和rAAV-CD151-AAA194-196两组间蛋白水平无明显差别,但rAAV-CD151-AAA194-196组大鼠缺血后肢平均皮肤温度和毛细血管密度明显低于rAAV-CD151组(均P<0.05)。结论研究证实CD151促血管新生是通过生成CD151-整合素α3/α6复合体而实现的,CD151-整合素α3/α6复合体的形成是CD151促血管新生的始动机制。

ICAP1α基因及其突变体T38A、I138A真核表达载体的构建和鉴定

目的:整合素β1-ICAP1α复合体在细胞黏附等过程中介导双向跨膜信号转导,并与囊泡特异性标记物共定位。文中构建并鉴定ICAP1α基因及其突变体T38A、I138A真核表达载体。方法:以pCMV-SPORT6/ICAP1α质粒为模板,PCR扩增ICAP1α基因片段,双酶切后与AAV载体重组连接。同时采用重叠PCR定点突变法构建其突变体pAAV-T38A、pAAV-I138A表达载体。重组质粒经酶切鉴定和DNA序列测定,筛选出重组pAAV-ICAP1α、pAAV-T38A和pAAV-I138A真核表达载体。结果:阳性重组质粒酶切后测序比对鉴定,与预期序列完全相符。结论:成功构建pAAV-ICAP1α、pAAV-T38A和pAAV-I138A真核表达载体,可为ICAP1α基因及其突变体T38A、I138A的生物学功能研究提供基因材料。

ICAP1α及突变体T38A、I138A在内皮细胞ECV304整合素β1内化中的作用

目的:探讨ICAP1α及突变体T38A、I138A在内皮细胞ECV304内化整合素β1中的作用和机制。方法:构建pAAV-ICAP1α及其突变体pAAV-T38A和pAAV-I138A真核表达载体,转染ECV304。ECV304分为ICAP1α组、T38A组、I138A组、绿色荧光蛋白(GFP)组和未转染组,用NHS-SS-Biotin标记整合素β1,并利用生物素-亲和素系统以及Westernblot检测整合素β1内化情况。结果:各组细胞转染的质粒均稳定表达;Westernblot检测ICAP1α组、T38A组、I138A组、GFP组、未转染组内化的整合素β1相对光密度值分别为1.07±0.04、0.68±0.06、0.70±0.02、0.87±0.06、0.88±0.04;与GFP组和未转染组比较,ICAP1α组整合素β1内化明显增多(P<0.05);与GFP组、未转染组和ICAP1α组比较,T38A组和I138A组整合素β1内化明显减少(P<0.05),GFP组与未转染组无差别(P>0.05)。结论:转染ICAP1α后内皮细胞ECV304表面整合素β1内化增加,而转染T38A和I138A后内皮细胞ECV304表面整合素β1内化减少;ICAP1α可能通过第38位的苏氨酸残基(38Tyr)和第138位的异亮氨酸残基(138Ile)调控整合素β1的内化。

剪切力对成纤维细胞中p38和CREB活性影响和作用机制

目的探讨剪切力对成纤维细胞中p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)和环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)活性影响及其调控机制。方法将成纤维细胞传代于培养皿中,细胞贴壁后采用不同作用时间和强度的剪切力(Shear stress)作用于成纤维细胞。为了探索剪切力作用的机制,分别加入活性氧(ROS)抑制剂过氧化氢酶和钙离子螯合剂BAPTA预处理成纤维细胞,剪切力作用30min后收集细胞。采用免疫印迹方法分别检测细胞中p38、CREB的活性。结果剪切力呈时间和强度依赖性方式促进成纤维细胞中p38、CREB磷酸化升高;在5dyn/cm2强度下,p38和CREB活性在10～30min时段逐步升高;在剪切力5dyn/cm2和7dyn/cm2作用30min后,p38和CREB的磷酸化水平均出现明显升高。ROS抑制剂Catalase抑制剪切力作用下成纤维细胞p38和CREB磷酸化,而钙离子螯合剂BAPTA增强p38和CREB磷酸化。结论剪切力通过ROS途径促进成纤维细胞中p38和CREB的磷酸化。