雏鹅人工感染沙门菌的病理组织学观察

为了研究沙门菌感染雏鹅的主要病理组织学变化。采取腹腔注射沙门菌人工感染7日龄健康雏鹅,对发病雏鹅进行病理剖检,并采取肺脏、肝脏、脾脏和肠道病料制作病理切片,光学显微镜下进行病理组织学观察。受感染雏鹅剖检病变可见皮下、心肌、肺脏、脾脏、肠道、脑膜等多处出血,肝脏坏死,胆囊、脾脏肿大;显微病理组织学变化为肝、脾、肺、肠道等器官出血、细胞变性、坏死,有炎性细胞浸润。结果表明,感染沙门菌雏鹅出现了广泛性的组织损伤,同时伴随着机体各器官明显的炎症反应。

重庆部分地区奶牛乳房炎葡萄球菌菌种的鉴定及毒力基因研究

为了了解重庆市荣昌区、永川区和巴南区奶牛乳房炎葡萄球菌的种类和生物膜相关基因的流行现状,试验对从重庆市荣昌区、永川区和巴南区18个奶牛养殖场分离得到的127株葡萄球菌采用全自动生化鉴定和葡萄球菌特异性基因dnaJ扩增及测序分析法进行葡萄球菌种的鉴定,并采用多重PCR扩增法进行毒力基因检测。结果表明:从127株葡萄球菌中鉴定出20种葡萄球菌,其中表皮葡萄球菌占18.90%,溶血葡萄球菌占12.60%,阿尔莱特葡萄球菌占11.81%,金黄色葡萄球菌占3.15%;采用多重PCR方法检测127株葡萄球菌的eno、clfB和fib等14个毒力基因,其中eno基因检出率高达40.16%,clfB基因检出率高达18.11%,未检测到icaB和icaC基因。说明引起本地区奶牛乳房炎流行的葡萄球菌以凝固酶阴性葡萄球菌为主,而非金黄色葡萄球菌,应加强对表皮葡萄球菌等凝固酶阴性葡萄球菌的临床防控。

鸭源大肠杆菌Ⅰ型菌毛的鉴定及FimA、FimH基因特征分析

为了解川渝部分地区鸭源大肠埃希菌Ⅰ型菌毛产生情况及分子特征,采用MSHA/MRHA试验、PCR扩增Ⅰ型菌毛基因(FimA、FimH)进行菌毛类型鉴定;通过分析FimA氨基酸序列的亲水性、抗原性、表面可及性来预测抗原位点。MSHA/MRHA试验结果显示,MSHA检测阳性率为44.3%;PCR检测FimA阳性率为63.41%,FimH阳性率为100%。氨基酸序列比对结果显示:FimA氨基酸序列与比对株大肠埃希菌(ECOR61)相比,存在19个差异位点;FimH氨基酸序列与比对株(ECOR45)相比,仅少数菌株出现1~2个氨基酸位点差异,表明该片段高度保守。对FimA氨基酸序列进行抗原位点预测,结果显示,多数菌株抗原表位共同区域分布在84~88、142~146、149~150位氨基酸之间,除上述位点外,部分菌株在101~105、130~134位氨基酸出现抗原表位。

牛源麦氏弧菌ASP基因的克隆与原核表达

为获得牛源麦氏弧菌重组碱性丝氨酸蛋白酶(ASP),笔者扩增并构建了以麦氏弧菌FD39-1的ASP基因为插入片段的重组表达质粒p ET32a-ASP,将该质粒转化至大肠杆菌Rosetta中诱导表达并纯化,采用SDS-PAGE与Western-blot技术检测目的蛋白是否表达成功。结果显示,扩增的ASP基因与GenBank中相应基因序列(Kp126900.1)的同源性达100%。ASP基因在大肠杆菌中成功表达,表达蛋白相对分子质量大小约为58 ku,与预期一致。Western-blot显示在预期位置出现阳性条带。本研究为麦氏弧菌ASP的生物学特性与亚单位疫苗的制备奠定了基础。

27株牛源肺炎克雷伯菌gyrA和parC基因遗传分析

为了解重庆和四川地区牛源肺炎克雷伯菌分离株之间的进化关系,本试验通过PCR方法扩增27株肺炎克雷伯菌gyrA、parC基因并测序,对测序结果进行基因进化分析。结果表明,gyrA、parC基因片段扩增产物大小分别为420,382bp;27株分离株可分成4个大簇,荣昌分离株主要与ha06(中国·江苏)、NCTC11228(荷兰·乌特勒支)等聚类于Ⅰ簇;丰都分离株紧密聚类于Ⅱ簇;Ⅲ簇全为云阳分离株;自贡分离株聚类于Ⅰ、Ⅳ簇。

兔出血症病毒衣壳蛋白VP60抗原区的原核表达及其免疫保护效果

目的原核表达兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)衣壳蛋白VP60抗原区,并检测其免疫保护效果。方法采用RT-PCR法从感染RHDV死兔肝脏中扩增RHDV VP60基因,克隆基因并进行测序和生物信息学分析。用柔性连接肽(Gly4Ser)3串联VP60蛋白两抗原区域,根据E.coli密码子偏好性优化合成编码串联蛋白的DNA序列,插入至原核表达载体pET30a(+),构建重组表达质粒,转化感受态E.coli BL21(DE3)。挑选阳性克隆菌培养,用终浓度1 mmol/L的IPTG诱导表达,产物经Ni^(2+)-NTA金属螯合蛋白层析纯化后进行SDS-PAGE和Western blot检测。将纯化蛋白经背部皮下免疫家兔,1.0 mg/只,共免疫3次,每次间隔2周。分别于免疫前、首次免疫后14、28、42 d经耳静脉采血,分离血清,ELISA法检测RHDV抗体水平;末次免疫2周,经家兔腿部肌肉注射RHDV SZ/2013强毒株病毒液,2 mL/只,每天观察家兔症状,攻毒后10 d剖解观察脏器病理变化。结果扩增的VP60基因序列与RHDV山东分离株VP60基因的核苷酸相似性最高,达95.86%,将该毒株命名为RHDV Chongqing/2016,明确了两抗原区段为VP60氨基酸序列的N-末端L区和C-末端H区。重组表达质粒经菌落PCR及测序鉴定,证明构建正确。纯化蛋白相对分子质量约50000,与兔抗RHDV多克隆抗体可发生特异性结合。家兔免疫14 d即产生了抗RHDV特异性抗体,随时间延长呈逐渐升高趋势,且较稳定;攻毒后10 d内家兔无死亡,采食正常,无病症出现,保护率达100%;剖检可见家兔肝、肺和肾等脏器均正常,未见出血症状。结论原核表达了RHDV衣壳蛋白VP60抗原区,且具有良好的免疫保护作用,本实验为相应疫苗的研发提供了实验依据。

山羊化脓隐秘杆菌分离鉴定及其神经氨酸酶遗传进化分析

为确诊重庆涪陵地区一山羊养殖场发生山羊皮下脓肿的病原，采集病料分离病原、进行药敏试验。通过生化试验和16SrRNA分子方法鉴定病原茵；PCR扩增分离株的神经氨酸酶基因（neuraminidase，NA），并利用细菌神经氨酸酶的隐马尔科夫模型（Pfam编号为PF13088）搜索自建的本地蛋白质组数据库，通过MEGA7．0构建系统进化树，从而分析神经氨酸酶基因在脊椎动物、寄生虫、真菌、细菌和病毒中的遗传进化特征，并利用PredictProtein进行分离株神经氨酸酶的点突变分析。结果表明，分离株的16SrRNA基因与JQ975932．1（中国新疆）株化脓隐秘杆菌序列同源性高达99．7％，结合生化特性确诊分离株为化脓隐秘杆菌；利用模型进行检索，共检索到214条神经氨酸酶氨基酸序列。神经氨酸酶遗传系统进化树显示，细菌神经氨酸酶主要集中在放线菌门中，脊椎动物的神经氨酸酶主要聚集在GroupⅠ和GroupⅡ，寄生虫的神经氨酸酶主要集中于GroupⅠ，真菌神经氨酸酶分布较广，存在GroupⅠ、GroupⅡ以及GroupⅣ中，而病毒神经氨酸酶主要分布于GroupⅠ和GroupⅡ。点突变分析表明，细菌神经氨酸酶不同位点的氨基酸突变对神经氨酸酶功能的影响不同。