当归多糖水提法正交设计及最佳Savag’s法去蛋白工艺

[目的]筛选出传统水提法提取当归多糖的最佳工艺及Savag’s法去蛋白时最佳操作次数。[方法]运用正交设计法设计提取工艺;采用Savag’s法去蛋白,并比较不同次数对多糖含量的影响。总糖含量测定采用改良苯酚-硫酸法;蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法;糖醛酸含量测定采用硫酸-咔唑法。[结果]提取的最佳工艺为:料水比1∶20、提取时间30 min、提取温度100℃;最佳去蛋白条件为:氯仿-正丁醇(5∶1),操作3次。[结论]该方法简便、易操作,适用于水溶性粗多糖的提取和检测。

实验性肿瘤细胞转移动物模型的活体成像观察

目的利用小动物活体成像系统观察肿瘤细胞在动物体内的转移情况。方法分别将不同浓度的绿色荧光蛋白（GPF）和荧光素酶（luciferase，Luc）双标的SMMC－7721细胞接种入裸小鼠尾静脉和脾，建立实验性转移动物模型，采用活体成像技术监测不同浓度的细胞在小鼠体内的转移情况，动态观察同一细胞于不同时间点在小鼠体内的转移情况。结果成功建立了尾静脉接种肺转移及脾内接种肝转移的实验性转移动物模型，经小动物活体成像系统检测发现，随着接种细胞浓度的增加，荧光素的表达面积和强度逐渐增加，二者呈正比关系；随着接种时间的延长，荧光素的表达面积和强度逐渐减弱，二者呈成反比关系。结论活体荧光成像系统可较好地观测肿瘤在动物体内深部脏器的转移情况，它将为肿瘤转移机制、抗转移治疗等研究提供有益的帮助。

应用iTRAQ技术筛选高转移和低转移肺腺癌细胞中差异表达的膜蛋白

目的:筛选高转移和低转移肺腺癌细胞中差异表达的膜蛋白,以寻找肺癌的生物学标志物或治疗的潜在靶点。方法:提取具有相同来源、不同转移潜能的肺腺癌SPC-A-1和SPC-A-1sci细胞的膜蛋白,应用核素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技术标记膜蛋白,联合纳升液相色谱和串联质谱(nanoliquid chromatography-tandem mass spectrometry,Nano-LC-MS/MS)分离、分析肽段,采用Proteinpilot 4.0软件对蛋白进行鉴定和定量分析,对获得的差异蛋白进行GO(Gene Ontology)分析,应用实时荧光定量-PCR和蛋白质印迹法进行验证。结果:样品进行4次NanoLC-MS/MS,鉴定出符合假阳性率<1%的分别有1413、1374、1297和1351个蛋白,标记率>95%,其中4次都上调的蛋白有27个(膜蛋白20个)、下调的蛋白有32个(膜蛋白25个)。GO分析显示,差异蛋白的分子功能主要集中在细胞骨架蛋白结合、同源蛋白结合和酶结合。生物学进程主要集中在代谢进程和细胞定位。SPC-A-1sci细胞中ITGA3(integrin alpha-3)、MYH9(myosin,heavy chain9)、PLEC1(plectin 1)、HADHA(3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase)、HK1(hexokinase-1)、KTN1(kinectin 1)、ESYT1(extended synaptotagmin-like protein 1)、ALDH18A1(aldehyde dehydrogenase 18 family,member A1)、ATP5A1(ATP synthase alpha-subunit)、LMNB2(lamin-B2)、CAV1(caveolin-1)和CK-19(keratin,typeI cytoskeletal19)mRNA的表达水平以及CLTC(clathrin,heavy chain)、HK1、LMNB2和CK-19蛋白的表达水平均高于SPC-A-1细胞,与质谱定量结果一致。结论:iTRAQ联合NanoLC-MS/MS技术能高通量地筛选与转移相关的膜蛋白,为肺腺癌患者转移的诊断和预后提供可能的生物学标志物或治疗靶点。

肺癌高转移和低转移细胞株中差异基因的分析

目的:以人肺癌低转移细胞株SPC-A-1为对照,分析人肺癌高转移细胞株SPC-A-1sci的分子转移机制及其相关的信号通路,寻找肺癌转移的关键基因。方法:应用芯片技术检测人肺癌低转移细胞株SPC-A-1和高转移细胞株SPC-A-1sci的差异基因。采用显著性通路分析和构建信号转导网络等生物信息学分析方法寻找肿瘤转移相关的潜在关键基因和信号通路。结果:与SPC-A-1细胞比较,SPC-A-1sci细胞共有上调表达的差异基因2892个,下调表达的差异基因3248个;上调差异基因参与的显著性信号转导通路共有48条,下调差异基因参与的显著性信号转导通路共65条。网络中的关键基因主要是丝裂原活化蛋白激酶1、表皮生长因子受体、AKT1、AKT3、PIK3CD(phosphoinositide-3-kinase,catalytic,delta polypeptide)、PIK3R1[phosphoinositide-3-kinase3,regulatory subunit1(alpha)]、PIK3R3、KRAS和胰岛素样生长因子1受体等。结论:人肺癌高转移细胞株SPC-A-1sci的基因芯片检测和生物信息学分析为肺癌转移的基础研究和临床防治提供了依据。

过表达CSRP1基因可促进人肺腺癌H1299细胞的增殖、迁移和侵袭

目的:探讨半胱氨酸和甘氨酸丰富蛋白1(cysteine and glycine rich protein 1,CSRP 1)基因过表达对人肺腺癌H1299细胞增殖、周期、迁移和侵袭的影响,及其可能的作用机制。方法:构建携带有CSRP 1基因的重组慢病毒质粒pCDH-CSRP1;将重组慢病毒Ad-CDH-CSRP1和pCDH-GFP(空载体对照组)分别感染人肺腺癌H1299细胞。实时荧光定量PCR及蛋白质印迹法检测CSRP1 mRNA及蛋白在H1299细胞中的表达水平。CCK-8法和克隆形成实验检测CSRP 1基因过表达对H1299细胞增殖能力的影响;FCM法检测CSRP 1基因过表达对H1299细胞周期的影响。Transwell小室迁移实验和划痕愈合实验检测CSRP 1基因过表达对H1299细胞纵向和横向迁移能力的影响,Transwell小室侵袭实验检测对细胞侵袭能力的影响。蛋白质印迹法检测CSRP 1基因过表达对H1299细胞中黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)和磷酸化FAK(phospho-FAK,p-FAK)蛋白表达水平的影响。结果:重组慢病毒质粒pCDH-CSRP1构建成功。转入重组慢病毒质粒pCDH-CSRP1的H1299细胞中CSRP1蛋白的表达水平较pCDH-GFP组明显提高(P<0.01)。CSRP 1基因过表达可促进H1299细胞增殖(P<0.05),G1期细胞所占百分比明显下降(P<0.01),S期细胞所占百分比明显上升(P<0.01);CSRP 1基因过表达可明显增强H1299细胞的迁移和侵袭能力(P值均<0.01)。CSRP 1基因过表达的H1299细胞中p-FAK蛋白的表达水平明显升高(P<0.01),而总FAK蛋白的表达水平无明显变化(P>0.05)。结论:CSRP 1基因过表达可增强人肺腺癌H1299细胞的增殖、迁移和侵袭能力,其机制可能与FAK信号转导通路的激活有关。