成功救治低体温综合征1例

低体温综合征(冻僵)是指人体由于各种原因导致机体核心体温下降到35℃以下的状态,常发生于严重低温外界环境中,主要包括冷水浸泡、寒冷作业等。低体温综合征时机体的病理生理会发生很大改变,各器官系统功能受损严重而广泛,甚至导致死亡。低体温综合征的救治难度大,本组病人通过快速复温,使中心体温快速回复至正常,复温与复苏同时进行,在复温的同时进行充分的静脉补液抗休克、纠正水电解质紊乱及酸碱平衡失调,并进行充分的器官功能保护,病人得到成功的救治。现对冷水浸泡致低体温综合征的研究较多,本例病人为长时间暴露于寒冷环境中导致,属冻结性冻伤,与冷水浸泡相比复温难度更大,救治过程亦有不同。

跟外侧皮瓣移位修复足跟后侧缺损6例

足跟后侧皮肤软组织缺损因局部软组织少修复较困难,且愈合后对耐磨性要求较高。为解决上述问题,笔者于2011年4月—2018年9月应用跟外侧皮瓣转移修复足跟后侧缺损6例,该皮瓣血管解剖位置恒定,血运可靠,具备良好的感觉功能,手术操作简单,不损伤重要血管,一次手术即可修复创面,术后外观、耐磨性及功能好,远期效果满意。

体外研究小鼠心肌细胞自噬过程中人抗原R对溶酶体酸化的作用

目的探讨人抗原R在体外培养的小鼠心肌细胞自噬过程中对溶酶体酸化的作用。方法取1~2d龄C57BL/6小鼠(雌雄不限)20只,分离心脏培养原代心肌细胞,进行以下实验。(1)采用随机数字表法(分组方法下同)将细胞分为5组,即正常对照组和无糖无血清0.5、1.0、3.0、6.0h组。正常对照组用DMEM/F12培养基常规培养(常规培养条件下同)54.0h,无糖无血清0.5、1.0、3.0、6.0h组常规培养53.5、53.0、51.0、48.0h后更换无糖无血清培养基分别处理0.5、1.0、3.0、6.0h,蛋白质印迹法检测细胞总蛋白中微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)、自噬相关蛋白5、腺苷三磷酸酶V1区E1亚基(ATP6V1E1)蛋白表达。(2)将细胞分为正常对照组和无糖无血清3.0h组,相应各组细胞处理同实验(1),激光扫描共聚焦显微镜下观测细胞溶酶体酸化水平。(3)取2个批次细胞,均同实验(1)分组处理,蛋白质印迹法检测一个批次细胞总蛋白及另一个批次细胞胞质、胞核蛋白中人抗原R蛋白表达。(4)将细胞分为正常对照组、单纯对照小干扰RNA(siRNA)组、单纯人抗原R-siRNA1(HuR-siRNA1)组、单纯HuR-siRNA2组、无糖无血清3.0h组、无糖无血清+对照siRNA组、无糖无血清+HuR-siRNA1组、无糖无血清+HuR-siRNA2组。常规培养48h后,单纯对照siRNA组及无糖无血清+对照siRNA组加入阴性对照siRNA、单纯HuR-siRNA1组及无糖无血清+HuR-siRNA1组加入HuR-siRNA1、单纯HuR-siRNA2组及无糖无血清+HuR-siRNA2组加入HuR-siRNA2转染6h,8组均继续常规培养48h后,正常对照组及各单纯siRNA处理组更换DMEM/F12培养基、其余各组更换无糖无血清培养基培养3h,蛋白质印迹法检测细胞总蛋白中人抗原R蛋白表达。(5)取2个批次细胞,均分为无糖无血清+对照siRNA组、无糖无血清+HuR-siRNA1组,相应各组细胞处理同实验(4),免疫荧光法观测一个批次细胞人抗原R分布及表达,激光扫描共聚焦显微镜下观测另一批次细胞溶酶体酸化水平。(6)取3个批次细胞,均分为无糖无血清3.0h组、无糖无血清+对照siRNA组、无糖无血清+HuR-siRNA1组、无糖无血清+HuR-siRNA2组,相应各组细胞处理同实验(4),蛋白质印迹法检测一个批次细胞总蛋白中组织蛋白酶D、一个批次细胞胞质蛋白中人抗原R及另一个批次细胞总蛋白中ATP6V1E1蛋白表达。(7)将细胞分为正常对照组、无糖无血清3.0h组、无糖无血清+对照siRNA组、无糖无血清+HuR-siRNA1组,相应各组细胞处理同实验(4),实时荧光定量反转录PCR法检测细胞ATP6V1E1mRNA表达。各实验样本数均为3。对数据进行独立样本t检验、单因素方差分析、LSD-t检验、Bonferroni校正。结果(1)与正常对照组比较,无糖无血清1.0、3.0、6.0h组细胞总蛋白中LC3Ⅱ、ATP6V1E1蛋白表达显著增加(t=12.16、4.05、4.82,11.64、3.29、8.37,P<0.05或P<0.01),无糖无血清0.5、1.0、3.0、6.0h组细胞总蛋白中自噬相关蛋白5蛋白表达显著增加(t=6.88、10.56、5.76、9.91,P<0.05或P<0.01)。(2)与正常对照组的1.03±0.08比较,无糖无血清3.0h组细胞溶酶体酸化水平(2.92±0.30)明显升高(t=6.01,P<0.01)。(3)5组细胞总蛋白中人抗原R蛋白表达组间总体比较,差异无统计学意义(F=1.09,P>0.05)。与正常对照组比较,无糖无血清1.0、3.0、6.0h组细胞胞质蛋白中人抗原R蛋白表达显著增加(t=43.05、11.07、5.39,P<0.05或P<0.01),无糖无血清3.0、6.0h组细胞胞核蛋白中人抗原R蛋白表达显著减少(t=11.18、12.71,P<0.01)。(4)与单纯对照siRNA组比较,单纯HuR-siRNA1组、单纯HuR-siRNA2组细胞总蛋白中人抗原R蛋白表达显著减少(t=4.82、4.44,P<0.05)。与无糖无血清+对照siRNA组比较,无糖无血清+HuR-siRNA1组、无糖无血清+HuR-siRNA2组细胞总蛋白中人抗原R蛋白表达显著减少(t=4.39、6.27,P<0.05)。(5)与无糖无血清+对照siRNA组比较,无糖无血清+HuR-siRNA1组细胞胞质中人抗原R分布减少、表达水平显著降低(t=10.13,P<0.01)。与无糖无血清+对照siRNA组的1.00±0.06比较,无糖无血清+HuR-siRNA1组细胞溶酶体酸化水平(0.73±0.06)显著下降(t=3.28,P<0.01)。(6)与无糖无血清+对照siRNA组比较,无糖无血清+HuR-siRNA1组、无糖无血清+HuR-siRNA2组细胞总蛋白中组织蛋白酶D、胞质蛋白中人抗原R、总蛋白中ATP6V1E1蛋白表达均显著减少(t=4.16、3.99,4.81、5.07,11.68、12.97,P<0.05或P<0.01)。(7)与正常对照组比较,无糖无血清3.0h组细胞中ATP6V1E1mRNA表达显著增加(t=5.51,P<0.05)。与无糖无血清+对照siRNA组比较,无糖无血清+HuR-siRNA1组细胞中ATP6V1E1mRNA表达显著减少(t=5.97,P<0.05)。结论小鼠原代心肌细胞在体外无糖无血清处理后自噬激活、溶酶体酸化增强、胞质中人抗原R表达增加,人抗原R功能激活并参与维持小鼠心肌细胞自噬过程中的溶酶体酸化。

体外研究己糖激酶Ⅱ在缺血缺氧小鼠心肌细胞自噬流变化中的作用

目的探讨己糖激酶Ⅱ在体外培养的缺血缺氧小鼠心肌细胞自噬流变化中的作用。方法取6只1~2 d龄雌雄不限C57BL/6小鼠,分离心脏并培养原代心肌细胞,取原代细胞进行以下实验。(1)按照随机数字表法(分组方法下同)将细胞分为6组,即正常对照3、6、9 h组及缺血缺氧3、6、9 h组,每组4孔。DMEM/F12培养基常规培养(常规培养条件下同)48 h后,正常对照3、6、9 h组更换新鲜DMEM/F12培养基分别培养3、6、9 h,缺血缺氧3、6、9 h组更换无糖无血清培养基后于37℃含体积分数1%氧气、体积分数5%二氧化碳的低氧培养箱(缺氧培养条件下同)内分别培养3、6、9 h。细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测细胞活力。(2)细胞分组及处理同实验(1),每组1孔。蛋白质印迹法检测细胞微管相关蛋白1轻链3 Ⅰ(LC3 Ⅰ)、LC3 Ⅱ、p62和己糖激酶Ⅱ蛋白表达。(3)将细胞分为正常对照组、单纯缺血缺氧9 h组和缺血缺氧9 h+2-脱氧葡萄糖(2-DG)组,每组4孔。常规培养48 h后,正常对照组更换新鲜DMEM/F12培养基培养9 h;单纯缺血缺氧9 h组更换无糖无血清培养基,缺血缺氧9 h+2-DG组更换溶有物质的量浓度为10 mmol/L 2-DG(20 μmol)的无糖无血清培养基,2组均缺氧培养9 h。CCK-8法检测细胞活力。(4)细胞分组及处理同实验(3),每组1孔。蛋白质印迹法检测细胞LC3 Ⅰ、LC3Ⅱ和p62蛋白表达。(5)细胞分组及处理同实验(3),每组2孔。透射电镜下观察心肌细胞中自噬体/自噬溶酶体情况。(6)将细胞分为正常对照组、单纯缺血缺氧9 h组、缺血缺氧9 h+己糖激酶Ⅱ小干扰RNA1(HK-ⅡsiRNA1)组和缺血缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA2组,每组4孔。正常对照组和单纯缺血缺氧9 h组常规培养48 h,缺血缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA1组和缺血缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA2组分别转染200 nmol/L HK-ⅡsiRNA1和HK-ⅡsiRNA2后常规培养48 h。正常对照组更换新鲜DMEM/F12培养基培养9 h,单纯缺血缺氧9 h组、缺血缺氧9 h+HK-Ⅱ siRNA1组和缺血缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA2组更换无糖无血清培养基后缺氧培养9 h。CCK-8法检测细胞活力。(7)细胞分组及处理同实验(6),每组1孔。蛋白质印迹法检测细胞LC3 Ⅰ、LC3Ⅱ、p62和己糖激酶Ⅱ蛋白表达。除实验(5)外,各实验均重复3次。对数据行单因素方差分析、LSD-t检验、Bonferroni校正。结果(1)缺血缺氧3、6、9 h组心肌细胞活力分别为0.450±0.022、0.385±0.010、0.335±0.015,分别明显低于对应正常对照3、6、9 h组的0.662±0.026、0.656 ±0.028、0.661±0.021(t=6.21、9.12、12.48,P<0.01)。(2)与对应正常对照3、6、9 h组比较,缺血缺氧3、6、9 h组心肌细胞LC3Ⅱ/Ⅰ比值、p62和己糖激酶Ⅱ蛋白表达均显著增加(t3h=16.15、10.99、5.30,t6 h=6.79、10.42、9.42,t9h=15.76、16.51、7.20,P<0.05或P<0.01)。(3)单纯缺血缺氧9 h组心肌细胞活力为0.353±0.022,较正常对照组的0.673 ±0.027明显降低(t=9.29,P<0.01);缺血缺氧9 h+2-DG组心肌细胞活力为0.472 ±0.025,较单纯缺血缺氧9 h组明显升高(t=3.60,P<0.05)。(4)与正常对照组比较,单纯缺血缺氧9 h组心肌细胞LC3 Ⅱ/Ⅰ比值及p62蛋白表达均明显增加(t=9.45、8.40,P<0.01);与单纯缺血缺氧9 h组比较,缺血缺氧9 h+2-DG组心肌细胞LC3 Ⅱ/Ⅰ比值及p62蛋白表达均明显减少(t=4.39、4.74,P<0.05)。(5)正常对照组心肌细胞中仅可见个别双层膜结构的自噬体/自噬溶酶体;与正常对照组比较,单纯缺血缺氧9 h组心肌细胞中双层膜结构的自噬体/自噬溶酶体明显增多;与单纯缺血缺氧9 h组比较,缺血缺氧9 h+2-DG组心肌细胞中自噬体/自噬溶酶体数量明显减少。(6)单纯缺血缺氧9 h组心肌细胞活力为0.358±0.023,较正常对照组的0.673 ±0.026明显降低(t=9.12,P<0.01);缺血缺氧9 h+HK-Ⅱ siRNA1组和缺血缺氧9 h+HK-Ⅱ siRNA2组心肌细胞活力分别为0.487 ±0.027、0.493±0.022,较单纯缺血缺氧9 h组明显升高(t=3.63、4.28,P<0.05)。(7)与正常对照组比较,单纯缺血缺氧9 h组心肌细胞LC3 Ⅱ/Ⅰ比值、p62和己糖激酶Ⅱ蛋白表达均明显增加(t=6.08、6.31、4.83,P<0.05或P<0.01);与单纯缺血缺氧9 h组比较,缺血缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA1组和缺血缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA2组心肌细胞中LC3Ⅱ/Ⅰ比值、p62和己糖激酶Ⅱ蛋白表达均明显减少(t=5.10、7.76、15.33,4.17、8.42、12.11,P<0.05或P<0.01)。结论缺血缺氧上调体外培养的小鼠心肌细胞己糖激酶Ⅱ蛋白表达水平,通过损害自噬流导致心肌细胞活力下降;抑制己糖激酶Ⅱ活性或其表达可减轻心肌细胞缺血缺氧损害。

体外研究瞬时受体电位香草酸亚型1对缺氧早期小鼠心肌细胞自噬的影响及机制

目的初步探讨瞬时受体电位香草酸亚型1(TRPV1)对体外培养的缺氧早期小鼠心肌细胞自噬的影响及机制。方法取120只1~2d龄雌雄不拘C57BL/6小鼠,分离心脏培养原代心肌细胞,并进行如下实验,分组方法均按照随机数字表法。(1)将细胞分为常氧组及缺氧3、6、9h组,每组1孔。常氧组细胞行常规培养(下同),缺氧3、6、9h组细胞采用不含胎牛血清的DMEM无糖培养基于体积分数1%氧气、5%二氧化碳、94%氮气的低氧条件下分别培养3、6、9h。蛋白质印迹法检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)、Beclin-1及TRPV1的蛋白表达。(2)将细胞分为常氧组和缺氧组,每组2张盖玻片,其中缺氧组细胞同前缺氧处理6h。免疫荧光法检测TRPV1的阳性表达。(3)将细胞分为4组,每组1孔。单纯缺氧组细胞同前行缺氧处理6h;缺氧+0.1μmol/L辣椒素组、缺氧+1.0μmol/L辣椒素组、缺氧+10.0μmol/L辣椒素组细胞分别加入0.1、1.0、10.0μmol/L辣椒素处理30min后,行缺氧处理6h。蛋白质印迹法检测LC3、Beclin-1及TRPV1的蛋白表达。(4)将细胞分为5组,每组5孔。缺氧组细胞同前缺氧处理6h;缺氧+氯喹组、缺氧+辣椒素组、缺氧+辣椒素+氯喹组细胞分别加入50μmol/L氯喹、10.0μmol/L辣椒素、50μmol/L氯喹+10.0μmol/L辣椒素处理30min后缺氧处理6h。细胞计数试剂盒8法检测细胞活力。(5)将细胞分为单纯缺氧组及缺氧+10.0μmol/L辣椒素组,每组1孔,前者细胞同前缺氧处理6h;后者细胞加入10.0μmol/L辣椒素处理30min后,行缺氧处理6h。蛋白质印迹法检测溶酶体相关膜蛋白1(LAMP-1)、LAMP-2的蛋白表达。各实验重复3次或5次。对数据行单因素方差分析、LSD-t检验、Bonferroni校正。结果(1)与常氧组比较,缺氧3、6、9h组心肌细胞中LC3、Beclin-1、TRPV1蛋白表达明显增高(t3h=4.891、5.890、4.928,t6h=9.790、6.750、10.590,t9h=6.948、6.764、5.049,P<0.05或P<0.01);缺氧6h组3种蛋白表达最高,分别为1.08±0.05、1.12±0.10、0.953±0.071。(2)缺氧组TRPV1在心肌细胞膜和胞内密度明显增加,呈团块状分布,表达明显强于常氧组。(3)与单纯缺氧组比较,缺氧+0.1μmol/L辣椒素组心肌细胞中Beclin-1蛋白表达明显增高(t=10.488,P<0.01),LC3和TRPV1蛋白表达虽增高但差异无统计学意义(t=4.372、3.026,P>0.05);缺氧+1.0μmol/L辣椒素组、缺氧+10.0μmol/L辣椒素组心肌细胞中LC3和TRPV1、Beclin-1蛋白表达均明显增高(t=15.505、5.773、13.430,20.915、8.054、16.384,P<0.05或P<0.01),其中缺氧+10.0μmol/L辣椒素组3种蛋白表达均达峰值,分别为2.33±0.09、1.34±0.07、1.246±0.053。(4)与常氧组(0.585±0.045)比较,缺氧组心肌细胞活力明显下降(0.471±0.037,t=4.365,P<0.05);与缺氧组比较,缺氧+氯喹组心肌细胞活力进一步明显下降(0.350±0.023,t=6.216,P<0.01),缺氧+辣椒素组心肌细胞活力则明显升高(0.564±0.047,t=3.489,P<0.05);与缺氧+氯喹组比较,缺氧+辣椒素+氯喹组心肌细胞活力无明显变化(0.364±0.050,t=0.545,P>0.05)。(5)与单纯缺氧组(0.99±0.04、0.54±0.04)比较,缺氧+10.0μmol/L辣椒素组心肌细胞中LAMP-1和LAMP-2蛋白表达明显增加(1.49±0.06、0.81±0.05,t=12.550、7.442,P<0.01)。结论TRPV1通过自噬-溶酶体途径进一步促进缺氧早期小鼠心肌细胞自噬相关蛋白的表达,增强自噬活性,改善自噬流,减轻早期缺氧心肌细胞的损伤。

CD38分子介导烧伤小鼠缺血缺氧性心肌损伤的机制

目的探讨CD38分子介导烧伤小鼠缺血缺氧性心肌损伤的机制。方法随机选取8周龄CD38-/-雄性小鼠和野生型(WT)雄性C57BL/6J小鼠各20只构建烧伤模型,动物实验分为WT对照组、CD38-/-对照组、WT烧伤组、CD38-/-烧伤组各10只,烧伤24 h后取材进行实验。利用出生1 d的小鼠乳鼠培养原代心肌细胞构建细胞缺血缺氧模型。细胞实验分为WT常氧组、CD38-/-常氧组、CD38-/-+Ad-CD38常氧组、WT缺血缺氧组、CD38-/-缺血缺氧组、CD38-/-+Ad-CD38缺血缺氧组。通过检测乳酸脱氢酶(LDH)释放及细胞活性明确心肌细胞缺血缺氧损伤程度;电镜检测心肌细胞超微结构;免疫印迹检测心肌细胞中CD38蛋白及线粒体凋亡相关蛋白水平;流式细胞技术检测心肌细胞线粒体活性氧(MitoSOX)水平;凋亡试剂盒检测心肌细胞凋亡情况;小动物超声仪检测小鼠心功能。结果(1)动物实验:WT烧伤组CD38表达水平显著高于WT对照组(P<0.001),CD38-/-烧伤组心功能明显优于WT烧伤组[射血分数:(84.70±2.31)%比(76.10±2.96)%;短轴缩短率:(48.90±5.00)%比(38.10±2.80)%](均P<0.001)。(2)细胞实验:WT缺血缺氧组CD38表达水平高于WT常氧组(P<0.05);CD38-/-缺血缺氧组LDH释放水平、心肌细胞凋亡率、MitoSOX水平均显著低于WT缺血缺氧组和CD38-/-+Ad-CD38缺血缺氧组[(11.2±3.0)%比(18.2±3.4)%和(17.6±4.0)%、(13.0±2.8)%比(23.1±4.9)%和(23.3±6.0)%、(162±11)%比(228±18)%和(220±18)%](均P<0.001),活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)3、细胞色素C也有相似结果(均P<0.001);细胞活性均显著高于上述两组(0.355±0.043比0.280±0.051和0.291±0.024)(均P<0.05)。电镜结果显示CD38-/-缺血缺氧组心肌细胞内线粒体结构优于WT缺血缺氧组及CD38-/-+Ad-CD38缺血缺氧组。结论心肌细胞内高表达的CD38分子促进线粒体凋亡因子释放,诱导心肌细胞凋亡,介导烧伤小鼠缺血缺氧性心肌损伤。